心律失常属于心血管系统中的常见病、多发病,可单独存在,也可伴随于其他器质性心脏病发作,其预后情况与病因、诱因以及血流动力学均有密切的关系。偶发的心律失常由于症状轻微,不需药物干预可自行缓解,且临床检查未见心脏器质性改变,因此人们对这种功能性心律失常重视程度不足。近些年来,由不良的生活习惯以及慢性病引发的功能性心律失常呈现逐年升高的发病率,且具有向恶性心律失常演变、发生高猝死率的特点,这些发病诱因均与微血管病变关系密切,因此改善微血管功能对于降低心律失常发病率具有重要意义。脉络学说认为,微血管的解剖位置分布与脉络末端之孙络具有同一性,并据此提出了“脉络—血管系统”的概念。“脉络—血管系统”是络脉系统的有机组成部分,因所处脏腑不同表现为不同疾病。分布于心脏的络脉包括心之气络与心之脉络,二者分别具有运行气血的功能,基于中医络病理论整体观念和气血相关的理论特色,心脏正常的搏动是心之气络与心之脉络协同作用的结果。心之气络弥散敷布经气的作用涵盖由窦房结发出的心脏传导系统、参与搏动的植物神经及部分高级中枢神经功能;心之脉络涵盖了冠脉循环系统,包括广泛分布于心肌的小血管及微循环。心之气络功能障碍可造成心脏搏动的速率、节律和心脏的传导系统异常,维持血管舒缩功能平衡的激素紊乱,发生心律失常;心之脉络功能障碍可引起心脏血流灌注不足,发生缺血缺氧,造成微循环障碍,微循环障碍以微血管内皮细胞损伤为核心和启动因素,内Calakmul biosphere reserve皮功能障碍与络脉自稳状态功能异常具有内在一致性,通过改善内皮功能可恢复络脉的气血运行,是防治微血管病变造成心律失常的重要治疗策略。依据络病理论研制的参松养心胶囊临床已证实具有“快慢兼治、整合调节”治疗各种类型心律失常的优势,实验研究也发现其具有保护内皮细胞功能的作用,因此本研究选用参松养心胶囊为治疗用药,探讨其对db/db小鼠心律失常易感性的干预作用机制,为其广泛应用于临床治疗内皮细胞损伤导致的心律失常提供实验数据支持。第一部分db/db小鼠心电图参数和心脏重构变化及参松养心胶囊干预作用研究目的:探讨db/db小鼠心律失常易感性、心电图参数、心脏结构重构、电重构和心肌细胞缝隙连接结构变化及参松养心胶囊的干预作用。方法:本研究选用雄性db/db小鼠及同窝对照小鼠作为实验动物,鼠龄在4-5周,每组10只。其中同窝对照小鼠为正常组(Control),不经药物干预的db/db小鼠为模型组(Model),参松养心低剂量组(SSYX-L)和参松养心高剂量组(SSYX-Hwww.selleck.cn/products/lxh254)分别给予参松养心0.4g/kg/d、1.6g/kg/d,在参松养心高剂量基础上加用一氧化氮合酶(e NOS)抑制剂NG-Nitro-L-arginine Methyl Ester,Hydrochloride(L-NAME)作为药物阻滞剂组(L-SSYX-H),以观察参松养心的作用部位是否在内皮细胞。每周测量各组小鼠体重及随机血糖,灌胃给药8周后,禁食水12h,每组随机选择6只进行在体心电图检测并通过腹腔注射异丙肾上腺素方式观察心律失常诱发情况,记录完成后取心脏组织液氮冻存完成后续指标检测;其余4只使用Mapping Lab矩阵式多通道电生理标测系统记录小鼠离体心脏心房及心室传导方向及传导时间,以观察参松养心对db/db小鼠心脏电重构的影响,记录完成后留取心脏组织多聚甲醛固定,HE及Masson染色观察心肌细胞形态结构变化以及心肌纤维化情况评估参松养心对db/db小鼠心脏结构重构的影响;实时荧光定量PCR(qPCR)检测心脏组织Kv 4.2、Kv 4.3、Nav 1.5、Cav 1.2 m RNA表达评价参松养心对db/db小鼠心脏离子通道重构的影响;Western blot检测心脏组织Cx43蛋白表达、酪胺信号放大(TSA)双重免疫荧光检测Cx43与α-actinin之间连接结构与分布,观察参松养心对db/db小鼠心脏缝隙连接结构的影响。结果:1.参松养心胶囊降低db/db小鼠心律失常诱发率观察小鼠腹腔注射异丙肾上腺素前后的心电图变化记录各组小鼠心律失常诱发情况。对比各组基线心电图可见,在6只小鼠中,Control组未见心电图异常;Model组有3只可见心电图异常;SSYX-L组有1只可见心电图异常;SSYX-H组有1只可见心电图异常;L-SSYX-H组有2只可见心电图异常。腹腔注射异丙肾上腺素后,Control组有1只出现心律失常,表现为阵发性房颤;Model组有6只出现心律失常,表现为阵发性房颤、室性早搏、房室传导阻滞等类型;SSYX-L组有3只出现心律失常,表现为阵发性房颤、房性期前收缩等类型;SSYX-H组有2只出现心律失常,表现为阵发性房颤;L-SSYX-H组有5只出现心律失常,表现为阵发性房颤、室性早搏、房室传导阻滞等类型。2.参松养心胶囊改善db/db小鼠异常心电图参数比较各组小鼠腹腔注射异丙肾上腺素前、后心电图参数发现,与Control组相比,腹腔注射异丙肾上腺素前后Model组及L-SSYX-H组PR间期、RR间期、P波时长、QT间期及QTc间期均明显延长(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,腹腔注射异丙肾上腺素前后SSYX-L组及SSYX-H组PR间期、P波时长、QT间期及QTc间期明显缩短(P<0.05,P<0.01),腹腔注射异丙肾上腺素后SSYX-H组RR间期明显缩短(P<0.05);与SSYX-H组相比,腹腔注射异丙肾上腺素前后L-SSYX-H组PR间期、RR间期、QT间期及QTc间期明显延长(P<0.05,P<0.01)。通过与腹腔注射异丙肾上腺素前相比,注射后各组小鼠心率明显升高(P<0.05,P<0.01),Control组、Model组及L-SSYX-H组RR间期、P波时长、QT间期及QTc间期均缩短(P<0.05,P<0.01),SSYX-L组及SSYX-H组PR间期未见明显变化(P>0.05)。3.参松养心胶囊改善db/db小鼠离体心脏传导方向,缩短传导时间Mapping Lab矩阵式多通道电生理标测系统结果显示,Control组及SSYX-H组传导方向有序,Model组、SSYX-L组、L-SSYX-H组传导方向紊乱无序。与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组心房及心室传导时间明显延长(P<0.01),SSYX-H组心房及心室传导时间接近Control组(P>0.05);与Model组相比,SSYX-H组心房及心室传导时间明显缩短(P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组心房及心室传导时间明显延长(P<0.05,P<0.01)。4.参松养心胶囊改善db/db小鼠心脏结构重构Masson三色染色结果显示,Control组心肌细胞之间结构排列紧密有规则,细胞之间未见明显胶原纤维沉积;Model组及L-SSYH-H组心肌细胞之间可见大量胶原纤维沉积;SSYX-L组和SSYX-H组小鼠心肌细胞之间胶原纤维沉积较Model组明显减少。HE染色结果显示,Control组心肌细胞排列整齐,未见坏死、肥大及炎性细胞浸润等情况。Model组和L-SSYX-H组出现部分心肌细胞肥大及坏死,可见大量炎性细胞浸润。与Model组相比,SSYX-L组和SSYX-H组心肌细胞排列较为规则,心肌细胞坏死和肥大情况明显改善,炎性细胞浸润明显减少。5.参松养心胶囊改善db/db小鼠心脏组织离子通道基因表达qPCR结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组Kv4.2、Kv 4.3、Nav 1.5、Cav 1.2 m RNA表达明显减少(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组Kv 4.3、Nav 1.5、Cav 1.2m RNA表达明显增加(P<0.05,P<0.01),SSYX-H组Kv 4.2 m RNA表达明显增加(P<0.05);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组Kv 4.3、Nav1.5、Cav 1.2 m RNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。6.参松养心胶囊改善db/db小鼠心肌细胞缝隙连接结构Western blot结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组CDinaciclibx43蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组Cx43蛋白表达明显增加(P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组Cx43蛋白表达明显降低(P<0.01)。TSA双重免疫荧光结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组Cx43与α-actinin连接结构紊乱,Cx43与α-actinin之间分布呈现分离状态,荧光密度降低。与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组Cx43与α-actinin连接结构清晰,Cx43分布于α-actinin的周围,荧光密度升高。与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组Cx43与α-actinin连接结构紊乱,Cx43与α-actinin之间无明显结构连接,荧光密度降低。小结:腹腔注射异丙肾上腺素后,db/db小鼠更易诱发心律失常,出现心电图参数异常、心脏结构重构及电重构、心肌细胞缝隙连接异常等表现。参松养心胶囊能够降低db/db小鼠心律失常易感性,改善异常心电图参数、心脏重构和缝隙连接结构。为了明确微血管内皮细胞损伤在心律失常中的作用,给予L-NAME作为抑制剂,参松养心的上述作用被抑制,提示db/db小鼠心律失常易感性增加可能与微血管内皮细胞损伤有关,参松养心胶囊可能通过改善内皮细胞功能降低心律失常易感性,因此后续实验继续探讨内皮细胞出现了哪些损伤是造成心律失常易感性增加的原因及参松养心胶囊的干预作用。第二部分db/db小鼠心脏微血管内皮细胞损伤增加心律失常易感性的可能机制及参松养心胶囊干预作用研究目的:通过检测db/db小鼠心脏内皮细胞屏障功能和分泌功能、微血管密度、炎性因子、黏附分子、巨噬细胞极化等指标,探讨db/db小鼠内皮细胞损伤及其介导的炎症反应在心律失常中的作用及参松养心胶囊的干预作用。方法:Western blot检测心脏组织中ZO-1、occludin蛋白表达评价内皮细胞屏障功能;免疫荧光双重染色观察心脏组织中CD31和e NOS荧光表达评价微血管密度;Western blot检测心脏组织中e NOS蛋白表达、亚硝酸盐比色法测定心脏组织中NO含量、qPCR检测心脏组织中ET-1m RNA表达评价内皮细胞分泌功能;qPCR检测心脏组织中IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA表达观察炎症反应情况;Western blot检测心脏组织中ICAM-1、VCAM-1蛋白表达观察黏附分子在损伤的内皮表面的黏附作用;Western blot检测巨噬细胞标志物MCP-1、CCR2蛋白表达、qPCR检测MCP-1与CCR-2 m RNA表达、免疫荧光双重染色观察心脏组织中F4/80与i NOS荧光密度作为巨噬细胞向促炎型极化的评价指标。结果:1.参松养心胶囊保护内皮细胞屏障功能Western blot结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组ZO-1和occludin蛋白表达明显降低(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组ZO-1和occludin蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组ZO-1和occludin蛋白表达明显降低(P<0.05)。2.参松养心胶囊改善内皮细胞分泌功能Western blot结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组e NOS蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组e NOS蛋白表达明显升高(P<0.05,P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组e NOS蛋白表达明显降低(P<0.05)。亚硝酸盐比色法结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组NO含量明显降低(P<0.05);与Model组相比,SSYX-H组NO含量明显升高(P<0.01),SSYX-L组变化不明显(P>0.05);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组NO含量明显降低(P<0.01)。qPCR结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组ET-1 m RNA表达明显增高(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组ET-1 m RNA表达明显降低(P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组ET-1m RNA表达明显增高(P<0.01)。3.参松养心胶囊增加心脏组织微血管密度双重免疫荧光标记CD31和e NOS观察微血管密度变化。与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组CD31和e NOS密光强度降低;与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组CD31和e NOS荧光密度增加;与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组CD31和e NOS荧光密度降低。4.参松养心胶囊抑制炎性反应qPCR结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA表达明显增高(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组IL-1β、IL-6 m RNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01),SSYX-H组TNF-αm RNA表达明显降低(P<0.05);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组IL-1β、IL-6、TNF-αm RNA表达明显增高(P<0.05,P<0.01)。5.参松养心胶囊抑制内皮细胞与炎性细胞的黏附作用Western blot结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组ICAM-1和VCAM-1蛋白表达明显升高(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组ICAM-1和VCAM-1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组ICAM-1和VCAM-1蛋白表达明显升高(P<0.01)。6.参松养心胶囊抑制巨噬细胞向促炎型极化通过检测巨噬细胞标志物MCP-1、CCR-2、F4/80验证巨噬细胞向促炎型(M1型)极化。Western blot结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组MCP-1蛋白表达明显升高(P<0.01),Model组CCR-2蛋白表达明显增高(P<0.05);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组MCP-1、CCR-2蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组MCP-1蛋白表达明显升高(P<0.01),CCR-2蛋白表达无明显变化。qPCR结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组MCP-1和CCR-2 m RNA表达明显增高(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组MCP-1和CCR-2 m RNA表达明显降低(P<0.05,P<0.01);与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组MCP-1和CCR-2 m RNA表达明显增高(P<0.01)。免疫荧光双重染色结果显示,与Control组相比,Model组及L-SSYX-H组F4/80与i NOS荧光密度增加;与Model组相比,SSYX-L组及SSYX-H组F4/80与i NOS荧光密度降低;与SSYX-H组相比,L-SSYX-H组F4/80与i NOS荧光密度增加。小结:db/db小鼠表现为心脏微血管内皮细胞屏障及分泌功能障碍,微血管密度降低,黏附分子表达增多,炎性因子表达增加,促进巨噬细胞向促炎型极化。参松养心胶囊能够改善内皮细胞的屏障和分泌功能,增加微血管密度,降低黏附分子表达和炎性因子表达,抑制巨噬细胞向促炎型极化。参松养心胶囊的作用可被e NOS抑制剂L-NAME阻断,提示参松养心胶囊可以通过e NOS通路保护内皮细胞。结合第一部分研究表明,内皮细胞屏障和分泌功能损伤及其介导的炎性反应可能是心律失常易感性增加的原因,参松养心胶囊可能通过e NOS通路抑制内皮细胞损伤及其介导的炎性反应,从而降低心律失常的易感性。第三部分高糖高脂诱导的微血管内皮细胞损伤及参松养心胶囊干预作用研究目的:通过检测微血管内皮细胞活性、线粒体功能、内质网功能、炎性因子、黏附分子等指标,探讨高糖高脂诱导的微血管内皮细胞损伤及参松养心胶囊的干预作用。方法:将人微血管内皮细胞分为5组:正常组(Control)、模型组(Model)、参松养心低剂量组(SSYX-L)、参松养心中剂量组(SSYX-M)、参松养心高剂量组(SSYX-H)。Model组给予高糖高脂培养基(25 mmol/L葡萄糖+50 mmol/L棕榈酸酯),SSYX-L、SSYX-M、SSYX-H组分别在Model组培养基的基础上给予0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml的参松养心药粉。各组细胞均放置于37℃含5%CO_2的培养箱中培养。CCK-8法检测各组细胞生存活性;荧光显微镜观察各组细胞线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)变化、Western blot检测各组细胞线粒体动力相关蛋白1(DRP1)及线粒体融合蛋白-2(MFN2)蛋白表达评估参松养心对高糖高脂诱导微血管内皮细胞线粒体功能的作用;Western blot检测各组细胞葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78),以观察参松养心对高糖高脂诱导微血管内皮细胞内质网功能的作用;Western blot检测各组细胞核转录因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65、IL-6蛋白表达,评估参松养心对高糖高脂诱导微血管内皮细胞炎性反应的影响;Western blot检测各组细胞P-selectin、E-selectin蛋白表达,评估参松养心对高糖高脂诱导微血管内皮细胞黏附分子的影响。结果:1.参松养心胶囊改善微血管内皮细胞生存活性CCK-8结果显示,与Control组相比,Model组细胞生存活性降低(P<0.01);与Model组比较,SSYX-L、SSYX-M、SSYX-H组细胞生存活性升高(P<0.01)。2.参松养心胶囊改善微血管内皮细胞线粒体功能采用荧光显微镜观察发现内皮细胞线粒体膜电位变化,Control组线粒体呈现红色荧光,说明线粒体膜电位较高;模型组呈现绿色荧光,说明线粒体膜电位下降,SSYX-L、SSYX-M、SSYX-H组均呈现红色荧光,说明参松养心胶囊能够提高线粒体膜电位。Western blot结果显示,与Control组相比,Model组DRP1蛋白表达明显增高(P<0.05),MFN2蛋白表达明显降低(P<0.01);与Model组相比,SSYX-M及SSYX-H组DRP1蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),SSYX-L组DRP1蛋白表达无明显变化(P>0.05),SSYX-L及SSYX-H组MFN2蛋白表达明显升高(P<0.05),SSYX-M组MFN2蛋白表达无明显变化(P>0.05)。3.参松养心胶囊改善微血管内皮细胞内质网功能Western blot结果显示,与Control组相比,Model组GRP78蛋白表达明显增高(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L、SSYX-M、SSYX-H组GRP78蛋白表达明显降低(P<0.01)。4.参松养心胶囊抑制微血管内皮细胞炎性反应Western blot结果显示,与Control组相比,Model组NF-κB p65、IL-6蛋白表达明显增高(P<0.05,P<0.01);与Model组相比,SSYX-L及SSYX-H组NF-κB p65、IL-6蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01),SSYX-M组NF-κB p65蛋白表达明显降低(P<0.01),SSYX-M组IL-6蛋白表达无明显变化(P>0.05)。5.参松养心胶囊降低微血管内皮细胞黏附分子水平Western blot结果显示,与Control组相比,Model组P-selectin、E-selectin蛋白表达明显增高(P<0.01);与Model组相比,SSYX-L组、SSYX-M组及SSYX-H组P-selectin、E-selectin蛋白表达明显降低(P<0.05,P<0.01)。小结:高糖高脂可降低微血管内皮细胞活性,导致内皮细胞线粒体功能障碍、内质网应激、炎性因子和黏附分子表达增多;参松养心可明显改善高糖高脂诱导的内皮细胞损伤的生存活性,抑制线粒体膜电位下降,使线粒体融合及分裂功能平衡,抑制内质网应激,降低炎性反应,抑制黏附分子表达。进一步证实参松养心胶囊对高糖高脂诱导损伤的内皮细胞具有保护作用。结合前两部分研究表明,微血管内皮细胞损伤及其介导的炎性反应是造成心律失常易感性增加的原因之一,参松养心胶囊能够通过抑制内皮细胞损伤及其介导的炎性反应降低心律失常的易感性。结论:1.络病理论指出,心之脉络与心之气络共同维持心脏的正常结构和功能。心之脉络推动血液运行,与心脏微血管功能密切相关;心之气络调控心脏节律和传导功能,与神经内分泌免疫调节功能密切相关。心之脉络结构功能异常可以引起心之气络功能异常,从而导致心脏结构功能损伤。本研究通过动物实验和细胞实验证实,微血管内皮细胞损伤及其介导的炎症反应可以导致心脏结构重构、电重构,增加心律失常易感性。保护微血管内皮细胞,可以抑制炎症反应,减轻心脏结构损伤,并降低心律失常易感性,由此表明络病理论对功能性或隐匿性心律失常的治疗具有重要指导价值。2.络病理论认为,心律失常以“气阴两虚,络虚不荣”为主要病机,治疗上应采用“损其心者,调其营卫”及“络虚通补”的治疗原则。本研究采用具有“温清通补,整合调律”作用的参松养心胶囊进行干预,结果显示其能够通过保护内皮细胞,抑制炎症反应,从而降低心律失常易感性,由此表明通络保护内皮细胞是防治功能性或隐匿性心律失常的重要治疗策略,为临床应用络病理论指导此类心律失常的防治提供了重要依据。