天然免疫是机体抵御病原体感染的第一条防线。在抵御病原体入侵的过程中,机体通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)以及损伤相关分子模式(Damage-associated molecular pattern,DAMP),活化细胞下游相关信号通路,并促进炎性细胞因子以及I型干扰素的合成与释放,从而限制病原体对机体造成的损伤。Toll样受体(Toll like receptors,TLRs)作为被人们研究最早、也是最为广泛的模式识别受体之一,在诱导天然免疫应答、抵御病原体感染以及维持机体稳态过程中发挥着重要作用。革兰氏阴性菌是导致机体感染、危害人类生命健康的重要因素。在革兰氏阴性菌感染过程中,天然免疫细胞尤其是巨噬细胞表面的TLR4通过识别细菌外壁组成成分脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)活化下游髓样分化因子88(Myeloid differentiation primary response gene 88,My D88)依赖或My D88非依赖信号通路,激活下游的核因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)以及TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)-干扰素调节因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)等,诱导相关细胞因子产生,从而控制细菌感染。但倘若TLR4通路过度活化,将造成炎性细胞因子过度释放,诱使机体发生“炎症风暴”,继而引发脓毒症或其他自身免疫性疾病。因此,TLR4介导的天然免疫反应如何维持在适度的活化水平是天然免疫研究领域的关键。泛素化(Ubiquitination)修饰作为蛋白翻译后修饰的重要一环,广泛调控机体的天然免疫反应。目前已有研究表明,E3泛素连接酶(E3 Ubiquitin Ligase)可通过促进TLR下游相关信号转导分子发生泛素化修饰,从而在炎症反应的启动、维持及消退过程中发挥关键调节作用。但E3泛素连接酶能否通过与TLR信号通路之外的其他分子相互作用进而影响天然免疫反应,目前研究相对较少,值得进一步深入探究。前期,我们发现内质网定位的含有RING结构域的E3泛素连接酶TRIM13(Tripartite motif-containing protein 13)能够通过调控干扰素刺激因子(Stimulator of interferon genes,STING)的转位和降解从而抑制环鸟嘌呤腺嘌呤合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,c GAS)-STING通路的反应强度,此外,我们也发现TRIM13的缺失能够促进LPS诱导的炎性细胞因子表达,但作用机制仍不清楚。本课题重点围绕TRIM13在调控LPS诱发的免疫炎症反应中的作用及分子机制进行研究。首先,我们在小鼠原代巨噬细胞中利用干扰RNA技术靶向敲低Trim13的表达,发现Trim13表达下调后能够促进LPS刺激导致的IL-6以及IFN-β表达,提示TRIM13参与调控TLR4信号通路反应。随后,我们在Trim13基因缺陷小鼠的原代巨噬细胞中使用LPS进行刺激,发现IL-6、TNFα和IFN-β的表达水平显著升高。在体内实验中,我们利用腹腔注射LPS的方式构建小鼠感染模型,发现TRIM13敲除小鼠在使用LPS诱导感染后,肺脏、肝脏以及肾脏等组织器官损伤及炎性细胞浸润水平均较野生型小鼠明显提高,且TRIM13敲除小鼠血清炎性因子水平明显升高。提示TRIM13在LPS触发的炎症反应过程中发挥了负向调控作用。为了进一步阐明TRIM13调控LPS触发的炎症反应的作用机制,我们利用LPS刺激Trim13野生型以及缺陷型的原代巨噬细胞,并利用Western blotting技术检测相关信号通路分子的活化情况,发现TRIM13的缺失能够显著促进p65、核因子κB抑制因子α(Inhibitorαof nuclear factorκB,IκBα)以及MAPK等分子的磷酸化水平,但对TBK1、IRF3的活化无明显影响,说明TRIM13参与调控LPS诱导活化的TLR4信号通路反应。接下来,为了明确TRIM13的相互作用分子,我们利用质谱分析(Mass Spectrometry,MS)、免疫获悉更多共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)以及免疫荧光共聚焦(Confocol)等技术,初步筛选到了TRIM13的相互作用蛋白,即基质相互作用分子1(Stromal interaction molecule 1,STIM1),并且发现TRIM13与STIM1的结合受到LPS刺激的影响。此外,通过构建二者的全长以及截短表达载体,我们发现TRIM13主要通过其跨膜结构域与STIM1的内质网腔外域相结合。为了进一步探索TRIM13的调控机制,我们检测了STIM1在Trim13敲除前后的泛素化水平。我们发现在敲除Trim13后,STIM1分子的泛素化水平发生下调,提示TRIM13促进STIM1泛素化修饰。随后,我们利用单一赖氨酸保留的泛素分子进行体外泛素实验,发现TRIM13能够促进STIM1分子发生K33连接的多聚泛素化修饰。鉴于TRIM13的内质网相关降解(Endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)活性以及STIM1同属于内质网定位蛋白,接着我们使用ERAD抑制剂以及利用分SCH727965子过表达技术,发现TRIM13参与调控STIM1的内质网相关降解,提示TRIM13可能通过介导STIM1发生K33连接的多聚泛素化从而促进其内质网相关降解。最后,考虑到STIM1分子在调控钙库操纵钙离子内流(Store-operated calcium entry,SOCE)中的作用,我们利用胞浆钙离子荧光探针检测SOCE强度,发现TRIM13缺失后可导致钙离子内流增多。鉴于钙离子在内质网蛋白质合成中的重要作用,我们检测了内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ER stress)活化相关分子指标,发现TRIM13的缺失能够促进未折叠蛋白反应(Unfolded protein response,UPR)相关分子表达及磷酸化。随后,我们通过分子过表达以及使用钙离子释放激活的钙离子(Ca~(2+)release activated Ca~(2+),CRAC)通道阻滞剂等,发现在TRIM13缺失的巨噬细胞中回补TRIM13以及抑制SOCE均能够抑制内Next Gen Sequencing质网应激,提示TRIM13缺失导致的钙离子稳态失衡是诱导细胞发生内质网应激并激活UPR的重要原因。而未折叠蛋白反应IRE1α-XBP1s通路的活化,是促进TLR4信号通路反应强度的潜在因素。综上,本课题阐释了TRIM13参与调控TLR4相关信号通路活化的效应和作用机制,即在静息状态下,TRIM13通过与STIM1分子相互结合并促进STIM1的内质网相关降解,从而维持内质网钙离子稳态。在LPS诱导TLR4信号通路活化后,TRIM13与STIM1的结合减弱,STIM1蛋白水平增加并促进钙离子内流,协助胞内炎性细胞因子合成。当TRIM13缺失后,STIM1分子大量堆积,从而造成内质网钙离子稳态失衡并诱发内质网应激,进而导致TLR4下游信号通路的过度活化。至此,本研究阐释了TRIM13在调控TLR4信号通路反应中的潜在作用机制,进一步加深了我们对TRIM13参与调控天然免疫反应的认知,并且为我们治疗TLR4反应相关的免疫性疾病提供了潜在靶点。