背景:人参皂苷Rh2不仅具有抗肿瘤功效,而且还具有免疫调节功能。在期前研究工作中,为提高Rh2的生物利用率,我们通过Rh2和辛酰氯合成Rh2辛酸酯(Octyl ester derivatives,Rh2-O),发现Rh2-O相比于其原型Rh2具有更高的细胞吸收率,且能发挥更强的抗癌活性,但具体作用机制还需进一步探索。免疫原性细胞死亡是一种特殊的细胞死亡类型,表现为受到化疗或放疗药物刺激后垂死的肿瘤细胞释放损伤相关分子模式(Damage Associated Molecular Patterns,DAMPs),DAMPs传递抗原信号,激活适应性免疫应答的过程。在前期工作基础上,我们再次提出Rh2-O能诱导癌细胞免疫原性细胞死亡的科学假设,并对Rh2-O诱导免疫原性细胞死亡的机制进行探究。目的:通过细Hepatocyte histomorphology胞实验及动物实验研究Rh2-O诱导Huh-7肝癌细胞免疫原性细胞死亡的作用及其可能的机制。方法:1.体外培养Huh-7细胞,设置Rh2-O药物组、空白对照组及阳性对照组。采用细胞增殖检测试剂盒Cell Counting Kit-8(CCK8)、流式细胞术分别检测细胞活力和细胞凋亡,酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)及化学发光法分别检测细胞上清高迁移率组蛋白B1(High Mobility Group Box 1,HMGB1)和三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)的含量,免疫荧光法检测细胞钙网蛋白(Calreticulin,CRT)的膜外翻。在动物疫苗实验中,将C57BL/6小鼠随机分为疫苗组和PBS组,Rh2-O处理的垂死的Hepa1-6肝癌细胞作为疫苗皮下注射至小鼠斜肋腹,另一组小鼠注射PBS作为对照组,一周后,用未经药物处理的正常Hepa1-6肝癌细胞注射至另一斜肋腹进行再攻击,每三天用游标卡尺记录小鼠的肿瘤大小,统计小鼠无瘤生存期、肿瘤生长情况及小鼠体重。2.荧光探针DCFH-DA检测细胞内活性氧水平,蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)法检测细胞内质网应激相关蛋白的表达水平,免疫荧光法检测内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-Phenylbutyric acid,4-PBA)对Rh2-O诱导Huh-7癌细胞CRT膜外翻的影响,实时荧光定量核酸扩增检测(Quantitative PCR Detecting System,QPCR)技术检测自噬相关基因的表达水平,WB法检测细胞自噬相关蛋白的表达水平,化学发光法检测自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)对Rh2-O诱导Huh-7癌细胞ATP分泌量的影响,利用线粒体红外荧光探针观察线粒体形态,免疫荧光法检测线粒体与LC3B蛋白的共定位,C57BL/6小鼠随机分为Rh2-O、Rh2-O+4-PBA、生理盐水组三组,将C57BL/6鼠源性Hepa1-6肝癌细胞皮下注射入小鼠斜肋腹构建小鼠肝癌模型,次日灌胃给药,Rh2-O组剂量为10mg/kg/d、Rh2-O+4-PBA组除了灌胃剂量为10mg/kg/d的Rh2-O外还需加上剂量为100mg/kg/d的4-PBA,灌胃体积为200μL,用游标卡尺每三天记录小鼠肿瘤大小,实验结束后统计脏器指数。结果:1.细胞实验结果显示,Rh2-O作用于细胞后显著降低细胞活力、促进细胞凋亡(P<0.05),诱导细胞HMGB1的分泌、ATP的释放及CRT的膜外翻(P<0.05)。动物实验结果显示,注射癌细胞疫苗组中11只小鼠在活的癌细胞再攻击后有4只小鼠出瘤,注射PBS组中7只小鼠在活的癌细胞再攻击后全部出瘤,PBS组小鼠的体重在实验观察后期急剧下降。表明Rh2-O可诱导肝癌细胞免疫原性细胞死亡。2.细胞实验中,Rh2-O使细胞内产生应激,蓄积大量的ROS(P<0.05),提高内质网应激信号通路相关蛋白如蛋selleck抑制剂白激酶RNA样内质网激酶(Protein kinase RNA-like Endoplasmic Reticulum Kinase,PERK)、真核翻译启动因子2a(eukaryotic translation Initiation Factor 2a,e IF2a)、磷酸化真核翻译启动因子2a(phospho eukaryotic translation Initiation Factor 2a,p-e IF2a)的表达水平(P<0.05)。内质网应激抑制剂4-PBA预处理后,可显著减弱由Rh2-O诱导的CRT膜外翻(P<0.05)PR-171纯度。同时,构建小鼠肝癌模型后,灌胃给药,Rh2-O组脾脏指数显著高于Rh2-O+4-PBA和生理盐水组,且Rh2-O显著抑制小鼠肿瘤的生长。说明Rh2-O诱导癌细胞免疫原性细胞死亡的机制可能与内质网应激有关,且Rh2-O在体内具有提高机体抗肿瘤免疫的功效。3.细胞实验中,Rh2-O可破环线粒体形态,提高自噬相关泛素结合蛋白62(Sequestosome 1,P62)、微管相关蛋白轻链3(microtubule associated proteins light chain 3,LC3)、自噬相关基因3(Autophagy Related 3,Atg3)的基因表达与自噬微管相关蛋白轻链3A(Autophagy related protein LC3A,LC3A)、自噬微管相关蛋白轻链3B(Autophagy related protein LC3B,LC3B)的蛋白表达水平(P<0.05),促进线粒体与自噬标志蛋白LC3B的共定位,自噬抑制剂3-MA预处理后可显著降低Rh2-O诱导Huh-7细胞ATP的分泌量。说明Rh2-O诱导癌细胞免疫原性细胞死亡的机制还可能与线粒体自噬有关。结论:Rh2-O可诱导肝癌细胞发生免疫原性细胞死亡,其机制可能与Rh2-O激活内质网应激促进细胞CRT膜外翻,诱导线粒体自噬有关。Rh2-O具有诱导癌细胞免疫原性细胞死亡的功效,具有一定的抗肿瘤免疫功能。