【研究背景】可降解骨修复材料可完全被机体降解吸收,并最终被自身骨组织所替代,因此被认为是一种较为理想的骨修复材料。目前常用的可降解骨修复材料主要包括高分子材料和生物陶瓷等,但通过单一材料制备的可降解骨修复支架在性能上存在一定缺陷。高分子生物材料(如聚乳酸,聚己内酯等)降解速率可控,但力学强度与成骨活性较差;陶瓷材料(如羟基磷灰石,磷酸三钙等)成骨活性与力学强度较高,但脆性大,体内植入后易碎裂。因此,将不同材料混合后制备复合可降解骨修复支架,能够弥补单一材料的不足,改善支架的骨修复效果。而如何选择不同成分配比,以优化支架成骨活性与降解模式,实现支架降解与新生骨长入同步进行,是目前该领域亟待解决的问题。课题组前期将聚己内酯(PCL)高分子材料与β-磷酸三钙(β-TCP)陶瓷材料以质量比例80:20混合后,通过熔融沉积(Fused Deposition Modeling,FDM)打印技术成功制备了PCL/β-TCP可降解骨修复支架。该可降解支架在绵羊颈椎前路减压融合(ACDF)模型中显示出良好的骨修复效果,但仍存在降解速率慢以及支架内部骨长入不足等问题。本课题进一步提高混合材料中生物陶瓷比例,成功制备了一系列不同比例的新型PCL/β-TCP支架(质量比例70:30-30:70),以期改善支架的降解过程与骨修复效果。然而,支架降解过程中各项理化性质(如力学性能,表面形貌以及成分构成等)动态变化,并伴随着降解产物的产生,这些因素均对局部免疫应答与骨修复过程产生动态影响,但相关作用与机制尚不清楚。因此,动态评价新型可降解PCL/β-TCP骨修复支架的降解过程,并阐明支架降解影响骨修复过程的作用效应及机制,对于优化可降解骨修复支架降解模式,提高支架骨修复效果有重要意义。【研究目的】制备不同比例3D打印的新型PCL/β-TCP可降解骨修复支架(质量比70:30-30:70);表征检测不同比例支架的理化性能与生物相容性;系统评价支架降解过程中各项理化性能的动态变化和降解产物的性质;明确支架的体内降解、骨修复与巨噬细胞应答情况;体外验证支架降解调控巨噬细胞应答及免疫调控成骨的生物学效应;基于转录组测序分析与功能验证,阐明支架降解影响巨噬细胞应答及免疫调控骨修复的相关机制。【研究方法】第一部分:通过FDM制备不同比例3D打印的PCL/β-TCP支架(PT支架;孔径:600μm;丝径:400μm);通过显微CT(Micro-CT)、扫描电镜(SEM)、元素能谱分析(EDS)、水接触角测量、压缩测试表征不同支架的三维结构、表面形貌、元素分布、亲水性与力学强度;X射线衍射(XRD)与傅里叶转换红外光谱(FTIR)检测支架的物相,化学键与官能团;凝胶渗透色谱(GPC)检测支架分子量;通过CCK-8与扫描电镜评价支架的细胞毒性与表面细胞黏附。第二部分:构建仿生动态降解装置用于PT支架的加速降解;SEM、GPC、压缩测试、XRD、FTIR、Micro-CT等方法评价支架降解过程中表面形貌、重量丢失、分子量、压缩强度、化学成分以及三维结构的动态变化;Micro-CT三维重建与透射电镜观察分析降解产物的形貌、粒径与结构。第三部分:将不同组别PT支架植入大鼠骨缺损模型,术后4周,10周和16周取材;采用Micro-CT扫描与重建,扫描电镜观察、骨组织荧光双标染色、脱钙组织Masson染色、免疫组织化学染色等技术,评价各时间点骨修复、selleck Pidnarulex血管新生以及支架降解情况;通过组织免疫荧光染色评价支架内部巨噬细胞的表型极化演变。第四部分:选取PT 73,PT 55与PT 37支架进行体外加速降解实验,通过扫描电镜联合元素能谱扫描匹配体内外支架降解时期;体外建立不同降解时期(D1-D3)支架与巨噬细胞的共培养体系,通过扫描电镜,免疫荧光染色,蛋白质免疫印迹等方法检测巨噬细胞表型与极化水平的动态变化;建立不同降解时期(D1-D3)支架的大鼠皮下埋植模型,检测支架内部组织应答与巨噬细胞极化情况;提取巨噬细胞条件培养基(Conditioned Medium,CM),测定CM中多种细胞因子的浓度;通过碱性磷酸酶染色与成管实验检测巨噬细胞CM对成骨分化与血管形成的免疫调控作用。第五部分:将巨噬细胞与体外降解D2时期的PT 55与PT 37支架共培养后行转录组测序分析;通过GO与KEGG富集分析差异功能与信号通路;基于测序结果,通过透射电镜观察,Western Blot,细胞荧光探针染色,流式细胞分析等方法进行功能验证;选择特异性抑制剂对相关靶点进行抑制,检测巨噬细胞应答与免疫调控功能的变化。【研究结果】第一部分 不同比例3D打印PT支架的制备与表征1、通过FDM打印成功制备了不同比例的PCL/β-TCP多孔支架(PT支架,质量比为70:30-30:70),分别为:PT 73支架(质量比70:30),PT 64支架(质量比60:40),PT 55支架(质量比50:50),PT 46支架(质量比40:60),PT 37支架(质量比30:70)。2、SEM结果显示各组PT支架的孔径均匀接近,Micro-CT扫描结果显示各组支架的孔隙率之间无统计学差异;EDS结果显示各组支架元素分布均匀,支架Ca元素和P元素含量随着陶瓷比例增加而显著升高。3、水接触角结果E1 Activating抑制剂显示高陶瓷比例PT支架亲水性更好;压缩实验的应力-应变曲线与压缩模量结果显示,陶瓷比例升高强化了支架的压缩强度。4、CCK-8结果显示支架的生物相容性良好,SEM显示成纤维细胞在支架表面充分铺展,与支架紧密黏附。第二部分 不同比例3D打印PT支架的体外动态降解过程评价1、体外构建仿生加速降解装置用于PT支架的降解研究,将氢氧化钠溶液作为循环装置的降解介质;将装置的液体循环速度设置1 ml/min,对不同PT支架(直径1 cm,高度0.2 cm)进行360 min的动态降解观察。2、PT 46与PT 37支架降解较快,在降解180 min时发生崩解,同时表面出现明显腐蚀;而PT 73,PT 64与PT 55支架降解相对平稳,在360 min时支架仅发生部分降解,支架表面无明显腐蚀。3、PT支架重量,分子量(数均分子量Mn)与压缩强度均随着支架降解而逐渐下降;PT 46与PT 37高陶瓷比例支架各项指标的下降速率显著高于PT 73,PT64与PT 55支架。4、XRD与FTIR结果显示:PT 46与PT 37支架在降解60 min时部分PCL的晶相与化学键特征峰消失;在降解360 min后,PT 64与PT 55支架的部分PCL特征峰也消失。5、Micro-CT横断图可见降解180 min后PT 73,PT 55以及PT 37支架内部出现降解孔洞,表面有高密度降解产物出现;三维重建与透射电镜结果显示,各组支架的降解产物在数量、形貌与尺寸上存在显著差异。第三部分 不同比例3D打印PT支架的体内动态降解、骨修复与巨噬应答研究1、Micro-CT三维重建及感兴趣区分析结果显示:PT 73,PT 64与PT 37组支架降解与骨组织长入同步发生,新生骨体积分数逐渐增加,支架体积分数平稳下降,骨修复过程顺利;PT 37与PT 46支架在4周时新生骨体积分数高,但由于支架快速降解,在10周与16周时支架内部新生骨体积降低并显著低于其它组。2、扫描电镜结果显示:PT 73、PT 64与PT 55支架在各时间点与周围骨组织均整合良好,支架表面无明显腐蚀现象。PT 46与PT 37支架在4周时与周围骨组织整合良好,但10周和16周时支架表面明显腐蚀降解,周围出现纤维状组织包裹。3、Masson组织染色结果显示:PT 73,PT 64和PT 55组支架的内部骨长入随支架降解而逐渐增多,在术后16周支架内部骨小梁连接成网状,实现骨缺损修复;PT 46与PT 37支架组4周时的新生骨面积高于其他组,但10周与16周时出现骨长入障碍,内部骨小梁吸收,高倍视野下可见支架周围存在多核异物巨细胞。4、免疫组化结果显示:PT 46与PT 37支架组4周时CD 31阳性内皮细胞数量高于其余组,但是10周与16周时血管新生受阻,内部内皮细胞数量显著低于PT73、PT 46与PT 55支架组。5、骨组织荧光双标结果显示:PT 46与PT 37支架4周时骨形成率(BFR/BS)高于其余组,但10周与16周时骨形成率明显降低并低于其余组。6、免疫荧光染色结果显示:PT 73与PT 55支架内部巨噬细胞逐渐由M1型(促炎型)极化状态过渡为M2型(促修复型)极化状态;PT 37支架组巨噬细胞的极化演变过程相反,10周与16周时支架内部主要为M1型(促炎型)巨噬细胞;支架降解中晚期介导的M1型巨噬细胞应答可能是导致骨修复失败的关键因素。第四部分 不同比例3D打印PT支架动态降解调控巨噬细胞极化影响成骨、成血管的效应研究1、通过扫描电镜联合元素能谱分析确定与4周,10周,16周体内支架匹配的体外支架的降解时期,定义为:降解早期(D1),降解中期(D2),降解晚期(D3);记录各组支架降解至不同时期的时间。2、将巨噬细胞与不同降解时期PT支架共培养;扫描电镜显示巨噬细胞在不同降解时期支架表面呈现两种典型形状:多伪足的球状巨噬细胞与伸长的扁平巨噬细胞;巨噬细胞形状随着体外支架降解发生动态变化。3、细胞免疫荧光与WB结果显示:巨噬细胞在PT 73与PT 55支架表面由D1时期的M1型极化逐渐向D2,D3时期的M2型极化状态转变;PT 37支架表面巨噬细胞的极化顺序则恰好相反,在降解D2与D3时期巨噬细胞呈M1极化表型。4、ELISA检测结果显示:D1时期PT 73与PT 55组巨噬细胞的IL-6与TNF-ɑ分泌水平高于PT 37组,而PT 37组的IL-10与TGF-β分泌水平更高。随着支架降解,PT 37组在D2与D3时期IL-6与TNF-ɑ的表达水平显著升高并高于其余各组。5、碱性磷酸酶检测与成管实验结果显示:PT 37组在D2与D3时期成骨前体细胞成骨分化与内皮细胞的血管形成能力显著低于其余各组。第五部分 不同比例3D打印PT支架动态降解调控巨噬细胞极化影响骨修复的机制探究1、RNA-seq结果显示:PT 55组与PT 37组共有1503个基因的表达水平存在差异(差异倍数≥2,P<0.05);PT 37组有1288个基因表达水平上调,215个基因表达水平下调;GO与KEGG富集注释结果显示PT 37支架降解显著促进了巨噬细胞吞噬与吞噬体的形成,提示巨噬细胞吞噬作用可能是支架降解调控巨噬细胞应答的一个关键靶点。2、溶酶体探针染色结果显示:D2降解时期PT 37支架组相较于PT 73与PT55组巨噬细胞的溶酶体数量显著升高;TEM观察结果直接证明了D2降解时期PT37支架降解促进了巨噬细胞吞噬体的形成,吞噬体直径显著高于其余组,吞噬体内部存在大量不均匀分布的支架降解产物。3、细胞免疫荧光、WB与流式细胞分析结果显示:D2降解时期的PT 37支架引起巨噬细胞的氧化应激以及活性氧水平的升高;通过吞噬功能抑制剂(Latrunculin B)处理巨噬细胞后,PT 37支架降解引发的巨噬细胞氧化应激与M1型极化水平降低,并且减轻了巨噬细胞对成骨分化与血管形成过程的抑制作用。【研究结论】1、通过熔融沉积打印方法可成功制备不同比例的PCL/β-TCP(PT;质量比70:30-30:70)可降解骨修复支架;增加陶瓷含量可有效改善PT支架的钙磷比例、亲水性以及压缩强度等理化性能,Cytokine Detection但同时促进了PT支架的降解与降解产物的产生。2、陶瓷含量增加提高了PT支架的早期骨修复效果,但高陶瓷PT支架(PT 46与PT 37)在降解中晚期造成血管形成与新生骨长入障碍,导致骨修复失败。3、PT 73、PT 64与PT 55支架降解过程中,巨噬细胞呈“M1促炎型-M2促修复型”序贯极化,促进了成骨分化与血管形成过程;而高陶瓷PT支架在降解中晚期介导了M1型巨噬细胞极化应答,抑制了成骨分化与血管形成过程。4、高陶瓷PT支架降解过程中产生大尺寸降解产物(直径>10μm),被巨噬细胞吞噬后诱导其氧化应激与M1型极化,从而抑制成骨分化与血管形成过程,最终导致骨修复失败。