化疗是胆管癌(cholangiocarcinoma,CCA)患者常用的治疗手段之一,由于CCA在诊断时多处于晚期,约70%的患者确诊时已不适用手术治疗。化疗在一定程度上也无法取得预期效果,由于复杂的耐药机制,CCA对抗肿瘤治疗药物不敏感,甚至耐药,一些耐药机制通常协同作用,使CCA细胞在不同程度上免于药物的抑制作用。研究显示,已有多达一百多个基因参与了包括CCA在内的不同肿瘤的耐药过程。高通量测序技术发展促进了生物信息学的发展,同时科研人员也鉴定出了众多耐药性相关基因。人体中仅有不到2%的基因组编码蛋白质,另有超过98%的转录产物是短链和长链非编码RNA(主要为micro RNA及lnc RNA)。lnc RNA即长链非编码RNA,它们由200多个核苷酸组成,且不具有蛋白质编码功能。与物种间高度保守的微小RNA(micro RNA)不同,lnc RNA在物种之间不太保守,通常低水平表达并具有较高的组织和发育特异性。lnc RNA参与基因组重要的功能调节,参与了基因转录、剪接和表观遗传学过程,并且参与了细胞周期Pexidartinib生产商、细胞分化、发育和生物多能性过程。近年来的研究显示lnc RNAs参与肿瘤治疗的耐药/敏感性过程。在过去的十年中,科研人员已经发表了许多关于lnc RNA和抗癌药物耐药性的研究论文。FALEC(focally amplified long non-coding RNA in epithelial cancer,上皮性癌症局灶扩增长非编码RNA)是位于1q21.2号染色体的lnc RNA,由566个核苷酸组成。研究分析显Angiogenesis抑制剂示FALEC在上皮癌中的表达上调,并通过靶向不同功能基因、调控消化道肿瘤的侵袭和转移,FALEC还介导了前列腺癌的治疗耐药性。5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-Fu)是胆管癌化疗方案中的常用药物之一,前瞻性临床研究及回顾性研究发现,胆管癌患者接受氟尿嘧啶为基础的二线治疗可以获益。但5-Fu治疗后耐药性的发展导致晚期CCA患者的预后不佳,因此阐明5-Fu潜在的耐药性机制有助于治疗患者预后的改善。在肿瘤中,肿瘤细胞内部支架的变化能够驱动肿瘤细胞的生长和迁移,另外还能使肿瘤细胞在无需获得特定基因突变的情况下,巧妙地避开药物的影响,使肿瘤细胞对包括化疗药物在内的药物产生耐药性。SHOC2(SHOC2 leucine rich repeat scaffold protein,SHOC2富含亮氨酸重复支架蛋白)是一种介导蛋白质相互作用的支架蛋白,研究表明,SHOC2作为支架可加速RAS-RAF(Rat sarcoma-rapidly accelerated fibrosarcoma,大鼠肉瘤蛋白-快速加速纤维肉瘤)相互作用,增强MAPK(mitogen-activated protein kinase,丝裂原活化蛋白激酶)信号传导。ERK(extracellular signal-regulated kinase,细胞外信号调节激酶)-MAPK通路在大多数肿瘤中上调,而针对ERK-MAPK通路的靶向抑制及化疗药物则在临床上受到耐药性和毒性的影响,使临床疗效受到影响。本研究通过分析上述基因在CCA体内及体外的变化,探索这些基因在CCA中的作用,同时明确这些基因在5-Fu耐药过程中扮演的角色,最终为CCA化疗药物的耐药机制研究及临床应用提供可靠参考。第一部分临床样本中长链非编码RNA FALEC与胆管癌5氟尿嘧啶耐药相关性的初步研究CCA是一种少见的胆道系统恶性肿瘤。CCA的异质性导致其治疗时缺乏有效的靶向治疗。对CCA的分子特征的进一步明确有助临床治疗方案的优化。随着测序技术的不断发展,非编码功能的RNA不断被发现,其中就包括lnc RNA。lnc RNA是一类长度大于200 bps的非编码RNA的总称。大量的研究证据显示lnc RNA在包括CCA在内的肿瘤发展过程中扮演重要角色。抗癌治疗对肿瘤及其生态系统具有强大的诱导变化作用。化疗和放疗会增加基因组的不稳定性,对存活细胞和非肿瘤细胞产生广泛的影响,通过诱导宿主的获得性耐药,削减抗肿瘤治疗的反应。耐药是影响肿瘤化疗效果的重要因素,近些年的研究还显示lnc RNAs介导了肿瘤细胞的耐药性或敏感性。研究显示FALEC在包括舌癌、胃癌、结直肠癌等消化道肿瘤中异常表达。FALEC通过靶向STAT3(signal transducer and activator of transcription 3,信号转导和转录激活子3),NUPR1(nuclear protein 1,transcriptional regulator,核蛋白1,转录调节因子),PDK1(pyruvate dehydrogenase kinase 1,丙酮酸脱氢酶激酶1),PTEN(phosphatase and TENsin homolog,同源性磷酸酶-张力蛋白)等基因调控胃癌、食管癌,结直肠癌这些肿瘤细胞的生长或增殖;通过靶向ECM1(extracellular matrix protein 1,细胞外基质蛋白1),AKT1(Akt serine/threonine kinase 1,Akt丝氨酸/苏氨酸激酶1),PTEN,FALEC进一步调控胃癌和卵巢癌中肿瘤细胞的侵袭和转移。在去势前列腺癌中,FALEC通过增强PARP1(poly(ADP-ribose)polymerase 1,聚(ADP-核糖)聚合酶1)介导了耐药性过程。5-Fu是治疗CCA的化疗药物,但其疗效因耐药性而受到影响。FALEC在CCA的5-Fu治疗耐药过程中的作用还有待于进一步的阐明。目的:分析不同临床特征CCA患者手术切除样本中FALEC的表达差异;分析5-Fu耐药诱导细胞系中FALEC的表达变化,并为第二部分的研究奠定工作基础。方法:采用RT-q RT-PCR(real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,实时荧光定量聚合酶链反应)方法,分析从临床收集的CCA手术切除样本中FALEC较非肿瘤对照组织的表达,以及接受5-Fu方案不同治疗反应患者样本中的表达差异。最后在体外采用浓度递增法诱导培养5-Fu耐药的CCA细胞系,分析耐药细胞系中FALEC的表达变化。结果:1.与非瘤对照切除组织相比,FALEC在肿瘤组织中的水平明显增加(P=0.003),并且TNM分期高的肿瘤组织中FALEC水平较TNM分期低的肿瘤组织中明显增加(P=0.0033),FALEC在不同部位CCA中的表达没有差异。2.对5-Fu治疗方案抵抗的患者,样本中FALEC水平明显高于5-Fu敏感的患者(P=0.0072)。3.CCA细胞系Hu CCT1,QBC939,Huh-28中FALEC水平高于人肝内胆管上皮细胞HIBEC。4.CCA细胞系经5-Fu诱导后,FALEC表达均增加,采用上调表达明显的2株细胞系QBC939-R和Huh-28-R(P=0.0021,P=0.0032 vs未诱导细胞系)用于进一步的研究。小结:1.FALEC在CCA患者肿瘤组织中表达明显升高,并且随着疾病严重程度而增加;2.5-Fu治疗耐药CCA患者样本及经5-Fu刺激后的CCA细胞中FALEC表达水平明显增加,提示CCA肿瘤组织中FALEC水平升高与5-Fu耐药有关。第二部分长链非编码RNA FALEC对胆管癌细胞生物学行为的影响Lnc RNA可根据长度、功能、位置和靶向机制进行分类,其中根据其功能机制可分为诱饵、支架、信号和引导lnc RNA。除了直接参与基因表达的调节,lnc RNA也可以作为竞争性内源RNA(ce RNA),与其他RNA转录物竞争相同的mi RNA,通过mi RNA相关通路发挥后续的调节功能。在体外研究中,通过外源构建的载体,上调或下调细胞中异常表达的基因,评估基因对靶细胞相关功能的影响,为基因进一步的机制研究打下基础。si RNA(small interfering RNA;小干扰RNA)是长度为20到25个核苷酸的双链RNA寡核苷酸序列,也被称为沉默RNA。si RNA可通过专一性的方式调节基因的表达。使用si RNA沉默lnc RNA是确定lnc RNA功能的有效技术手段。第一部分的研究结果显示,FALEC在5-Fu治疗耐药的临床样本中及5-Fu诱导的耐药细胞中均出现表达上调,提示上调表达的FALEC可能参与了CCA的5-Fu耐药过程,并可能促进CCA细胞恶性生物学行为。通过构建外源si RNA,在CCA细胞中沉默FALEC并评估细胞增殖、迁移的功能变化有助于明确FALEC在CCA及5-Fu耐药中的功能。目的:通过构建外源高效的FALEC干扰序列,分析沉默FALEC后对CCA 5-Fu耐药细胞增殖,迁移和侵袭等生物学行为的影响。方法:设计FALEC干扰序列,评估干扰序列在CCA 5-Fu耐药细胞中对FALEC的干扰效率。采用CCK-8法和细胞克隆形成实验检测沉默FALEC后对细胞增殖能力的影响。再通过细胞划痕实验和Transwell实验分析沉默FALEC后,CCA 5-Fu耐药细胞中迁移和侵袭能力的改变情况。结果:1.同转染阴性对照序列(si-NC)的细胞株相比,FALEC沉默后(si-FALEC)FALEC在QBC939-R和Huh-28-R细胞中明显降低(P均<0.001)。2.CCK-8实验分析显示QBC939-R和Huh-28-R转染si-FALEC后,两株细胞的增殖能力均出现了明显的降低。3.转染si-FALEC后,CCA耐药细胞株克隆形成能力较转染阴性对照序列的细胞株(si-NC)明显减低(P=0.0031,P=0.0004)。4.沉默FALEC后CCA耐药细胞株QBC939-R和Huh-28-R的迁移能力下降明显(P均<0.001)。5.沉默FALEC削弱了5-Fu耐药株QBC939-R和Huh-28-R细胞的侵袭能力(P均<0.001)。小结:在5-Fu耐药细胞系中使用si RNA沉默FALEC明显降低了耐药细胞系增殖、侵袭等恶性行为,表明CCA细胞中上调的FALEC与5-Fu治疗的不良预后有关。第三部分长链非编码RNA FALEC在胆管癌中影响5氟尿嘧啶药物抵抗的机制研究CCA的发生机制复杂,新的分子标记物为疾病的致病机制及驱动其进展的信号通路研究提供了新的思路。mi RNAs表达失调是肿瘤形成的重要因素之一。除了直接吸收mi RNA或ce RNA,lnc RNA还可作为mi RNA的前体发挥其作用。lnc RNA和mi RNA也可以竞争性结合m RNA的相同位点,防止mi RNA靶向的m RNA降解。在线lnc RNA数据库收集了众多高通量测序数据,这些数据库为lnc RNA的作用和功能研究提供了详实的参考内容,有效提高了lnc RNA功能研究的效率。微小RNA mi R-20a-5p与肿瘤发展密切相关,其参与多种机制发挥调控功能,包括持续增殖信号、逃脱生长抑制、侵袭性和转移性激活、复制永生、血管生成、抵抗细胞死亡和避免免疫损伤等。体内研究证实外源上调表达mi R-20a-5p抑制了MAPK/ERK及c AMP/PKA(cyclic AMP/protein kinase A,环状AMP/蛋白激酶A)信号通路的激活,从而显著改善了荷瘤裸鼠治疗的耐药性。支架蛋白是许多关键信号通路中的重要调控因子,支架蛋白SHOC2与Ras-Raf-ERK信号通路激活有关。它可以促进c-Raf的激活,从而激活c-Raf-MEK(MAPK/ERK kinase,MAPK/ERK激酶)-ERK信号通路。许多研究报道了SHOC2在调节耐药性中的重要作用,在非小细胞肺癌细胞中,SHOC2是EGFR-TKI(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂)治疗敏感性的关键调节蛋白,SHOC2缺失则进一步增强了MDA-MB-231乳腺癌细胞对MEK抑制剂的敏感性。在线生物信息学工具的进一步分析还显示,SHOC2可能是mi R-20a-5p潜在的靶向调节功能基因。因此在第三部分的研究中探索和验证了FALEC经mi R-20a-5p/SHOC2作用通路参与5-Fu在CCA耐药中的机制。目的:利用在线生物信息学工具,探索能够潜在结合FALEC的mi RNA,并研究调节5-Fu耐药的作用通路。方法:1.使用在线网站工具ENCORI和DIANA-Lnc Base分析能够与FALEC潜在结合的RNA及mi RNA基因。2.使用双荧光素酶报告实验验证FALEC与靶基因的结合情况。3.通过构建的靶mi R-20a-5p模拟物(mi R-20a-5p mimic)及阴性对照序列,转染5-Fu耐药细胞系QBC939-R和Huh-28-R。并分析敲除FALEC后靶基因表达的变化。4.采用CCK-8(cell counting kit-8,细胞计数试剂盒-8)法评估上调mi R-20a-5p后耐药细胞增殖的变化及不同浓度5-Fu下细胞药物敏感性的变化。5.根据在线工具网站预测结果和文献检索结果,确定mi R-20a-5p调节的靶基因及相关信号通路。6.采用相关性分析、功能获得及功能失去研究,确定相关基因间的相互调节关系。7.采用蛋白免疫印迹分析方法,分析验证相关通路中关键蛋白的表达变化。结果:1.生物信息学及文献检索结果提示FALEC可能通过吸附mi R-20a-5p发挥调节作用。2.对5-Fu敏感组织和耐药组织检测后发现5-Fu耐药组织中mi R-20a-5p的水平明显降低。同时还发现mi R-20a-5p在QBC939-R和Huh-28-R细胞中比未经诱导的细胞表达明显降低。3.-Fu耐药细胞系QBC939-R和Huh-28-R中沉默FALEC后,mi R-20a-5p的表达水平明显增加。4.双荧光素酶实验显示mi R-20a-5p同FALEC野生型序列共转染细胞中荧光素酶活性明显降低。5.通过在线工具(ENCORI、Target Scan、mi RDB和Mir Tar Base)筛选mi R-20a-5p的潜在靶向功能基因。结合文献检索结果及在线工具网站DIANA-mi RPath分析mi R-20a-5p的相关通路,结果提示MAPK通路与mi R-20a-5-p的调控功能有关。6.生物信息学分析显示MAPK通路中SHOC2是潜在的结合基因之一。7.临床收集样本中SHOC2 m RNA和mi R-20a-5p表达的相关性分析显示SHOC2 m RNA与mi R-20a-5p表达呈负相关。8.通过mi R-20a-5p mimic外源上调mi R-20a-5p的表达后,5-Fu耐药细胞中SHOC2 m RNA及蛋白的表达水平出现明显下降。9.将FALEC过表达质粒(FALEC OE)转染QBC939和Huh-28细胞后,这2株CCA细胞系的耐药性增强;外源增强mi R-20a-5p表达后,5-Fu敏感性增强;沉默SHOC2后,FALEC OE导致的CCA细胞5-Fu耐药性显著下降。10.采用蛋白质印迹(western blot)检测上述不同处理细胞中SHOC2及MAPK信号通路的关键蛋白ERK1/2,p ERK1/2水平。FALEC过表达质粒增强了SHOC2和p ERK1/2蛋白水平;mi R-20a-5p mimic则削弱了FALEC过表达质粒的增强效沉默SHOC2后,FALEC OE增强的p ERK1/2蛋白水平同样明显下降。小结:1.在CCA中,FALEC可通过内源性竞争mi R-20a-5p发挥调节作用。MAPK通路中的SHOC2是FALEC调节的功能基因。2.在CCA中针对FALEC或mi R-20a-5p,靶向性下调或上调这2个immediate allergy基因的表达,可能是改善CCA治疗时5-Fu耐药的策略之一。