【目的】催乳素(Prolactin,PRL)具有广泛的生理调节作用，但其多效性机制仍不清楚。为了更好地研究猪PRL的多效性，本研究制备猪源PRL真核重组蛋白并验证其生物活性。【方法】利用分Colforsin配制子克隆技术将猪PRL基因克隆到慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP+Puro中，经慢病毒包装获得携带猪PRL基因的PRL-慢病毒；用浓缩的PRL-慢病毒感染CHO-K1细胞，经嘌呤霉素筛选后，获得能够分泌PRL重组蛋白的阳性细胞系CHO-K1-PRL；利用镍柱亲和层析法对重组蛋白进行纯化并进行LC-MS/MS质谱鉴定，利用HC11细胞体外培养体系验证PRL重组蛋白的生物活性。【结果】成功构建了携带猪PRL基因的pCDH-CMV-6Hisinfections respiratoires basses-PRL-6HisEF1-GFP+Puro慢病毒表达载体；包装及浓缩后的PRL-慢病毒滴度为9.9×108 TU/mL，其感染的CHO-K1细胞经嘌呤霉素筛选后得到阳性细胞系CHO-K1-PRL；从CHO-K1-PRL细胞培养液中成功纯化出重组蛋白，质量浓度为50μg/mL,LC-MS/MS质谱分析的覆盖率达94%，鉴定为猪PRL重组蛋白；重组PRL具有促进HC1C59核磁1细胞增殖及酪蛋白表达的生物活性。【结论】构建的细胞系CHO-K1-PRL可稳定表达具有生物活性的猪重组PRL，为猪PRL功能的研究和生产应用奠定了基础。