目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种病因及发病机制尚不明确,累及多系统、多器官,严重影响患者生活质量和寿命的自身免疫性疾病,临床多表现为皮肤黏膜损伤、狼疮肾炎等症状。过度活化的免疫系统,B细胞分泌抗体增多,Foxp3~+Treg(Forkhead box p3 regulatory Timmune homeostasis cell)数量降低以及Th17/Treg细胞免疫失衡是SLE发病的关键环节。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类拥有强大免疫调节能力、多向分化能力、免疫原性低的成体干细胞,M SCs治疗已被广泛应用到多种人类疾病的治疗当中。然而有文献报道,S LE是一种干细胞疾病~([1,2]),由于遗传因素和过度活化的免疫系统,会导致SLE患者的MSCs出现衰老、免疫调节能力下降等缺陷,因此临床实验研究多采用异体MSCs对SLE患者进行细胞治疗,但多次治疗后带来的移植排斥反应存在着引发机体免疫系统进一步活化,给患者带来更为严重的损伤的风险。因此我们希望通过分子生物等手段,修复SLE患者MSCs的缺陷,并将其应用于SLE的治疗当中。本课题将通过了解系统性红斑狼疮小鼠(MRL/lpr小鼠,含Fas基因突变)的脂肪间充质干细胞(L-A DSCs)在体外培养过程中增殖、衰老、凋亡、免疫调控等方面的情况,以及MRL/lpr小鼠的脂肪间充质干细胞(L-ADSCs)与健康对照鼠C57B L/6J的脂肪间充质干细胞(H-ADSCs)在治疗MRL/lpr小鼠疗效上的差异,为后续修复L-ADSCs缺陷,实现应用狼疮小鼠自体MSCs治疗奠定研究基础。方法:1.细胞鉴定:体外分离、培养L-ADSCs与H-ADSCs,通过相差显微镜观察细胞形态,成骨、成脂、成软骨诱导分化培养基检测细胞分化能力,流式细胞术检测细胞表面标记CD29、CD34、CD44、CD45、CD105表达情况。2.细胞增殖能力检测:CCK-8检测H-ADSCs及L-ADSCs体外培养0-7天增殖能力的差异。3.细胞衰老检测:相差显微镜观察两种来源ADSCs同代细胞的形态学差异,Western Blotting检测p-p65、p16~(INK4A)、c-Maf等细胞周期相关蛋白表达情况,RT-PCR检测衰老相关基因p15~(INK4B)、p16~(INK4A)、c-Maf m R NA表达情况。4.细胞凋亡检测:通过RT-PCR、Western Blotting检测H-ADSCs及L-ADSCs凋亡相关基因Bcl-2、caspase3的表达情况,Annexin V-FITC/PI染色分析H-ADSCs及L-ADSCs凋亡差异。5.迁移能力检测:通过细胞划痕实验研究H-ADSCs及L-ADSCs迁移愈合能力有无差异。6.免疫调节能力检测:通过RT-PCR、Western Blotting检测TGF-β、IL-6、p-STAT1、IDO1等免疫调控相关基因表达情况。7.动物实验:将15只22周雌性MRL/lpr狼疮小鼠随机分为对照组、H-ADSCs治疗组、L-ADSCs治疗组3组,每组5只,于小鼠22周龄时通过尾静脉注射的方式首次移植H-ADSCs或L-ADSCs(1×10~6个/只),对照组注射等体积PBS。于小鼠首次移植治疗2周后进行第二次细胞移植治疗,治疗5周后处死小鼠。每周记录小鼠体重变化,每两周收集一次小鼠24h尿液,通过CBB法测定小鼠24h尿蛋白含量。流式细胞术检测小鼠脾脏免疫细胞Th17、Treg细胞数量及比例,RT-PCR检测小鼠脾脏免疫细胞因子m RNA表达情况,HE、PAS染色检测小鼠肾脏病理变化,C BB法检测小鼠治疗前、治疗2周、治疗5周尿蛋白变化。结果:1.体外培养ADSCs细胞形态呈长梭形;经诱导可分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞;流式细胞术检测结果显示CD29、CD44、CD105均为高表达,CD34、CD45均为低表达。2.相较于H-ADSCs,L-ADSCsselleck Galunisertib体外增殖能力较低,细胞立体感弱,形态扁平化,边界不清晰,胞质内颗粒分泌物明显较多。3.RT-PCR结果显示L-ADSCs衰老相关基因c-Maf、p15~(INK4B)、p16~(I NK4A)m RNA表达高,凋亡相关基因caspase3升高,原癌基因Bcl-2表达减低,促炎因子IL-6表达较低,抑炎因子TGF-β表达较高。4.Western Bolt结果显示,L-ADSCs的衰老相关蛋白p-p65、p16~(INK4A)及凋亡相关蛋白cleaved caspase3表达水平较高,c-Maf无明显差异。5.流式细胞术结果显示L-ADSCs凋亡、坏Captisol配制死细胞比例明显高于H-ADSCs,正常细胞比例低于H-ADSCs。6.动物实验中,相较于对照组,H-ADSCs治疗组及L-ADSCs治疗组的MRL/lpr小鼠体重均明显升高,两治疗组间无显著差异;脾脏炎症因子TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-17均明显低于对照组,抑炎因子TGF-β明显高于对照组,但两治疗组间无显著差异;血清中IL-6、IL-17均低于对照组,两组间无显著差异;流式分析结果显示,与对照组相比,经H-ADS Cs或L-ADSCs移植治疗后,MRL/lpr小鼠脾脏免疫细胞Th17/Treg比例失衡现象有所减低,Th17细胞占比减低,Treg细胞占比升高,两治疗组间,H-ADSCs治疗组Th17细胞比例减低更明显,L-ADSCs治疗组Treg比例升高更明显,差异具有统计学意义;病理切片HE、PAS染色结果显示,与对照组相比,H-ADSCs治疗组及L-ADSCs治疗组MRL/lpr小鼠肾间质炎细胞浸润程度明显减轻,肾小管上皮细胞水肿、肾小管管腔扩张现象减轻,肾小球毛细血管内细胞数量未见明显差异,肾小球系膜有增生现象,两治疗组间未见明显差异;此外,L-ADSCs治疗组皮肤损伤症状最轻。结论:1.来源于MRL/lpr小鼠的脂肪间充质干细胞(L-ADSCs)增殖能力差,更早出现衰老表型,衰老、凋亡相关基因及蛋白表达高,迁移能力减低,免疫抑制相关因子表达较强。2.应用健康小鼠的H-ADSCs及MRL/lpr狼疮小鼠L-ADSCs治疗都表现出明显的治疗效果,两组间在疗效上未见显著差异。