目的:1.在体水平观察创伤大鼠心肌组织GRP78及GRP78乙酰化水平随时间的变化情况,并探究后者与心肌细胞凋亡的关系。2.离体水平进一步分析GRP78乙酰化程度对创伤心肌细胞凋亡的影响,并对其作用机制进行初步探索。3.离体水平探究GRP78乙酰化对创伤后心肌细胞GRP78表达的影响。方法:1.在体水平:将180-200 g、6-8周、雄性SD大鼠随机分为伪创伤组(n=8)、创伤组(包括创伤后0 h、3 h、6 h、12 h和24 h六个时间点)(n=8/组)。腹腔麻醉大鼠后,使用Noble-Collip创伤仪制备创伤大鼠模型;将大鼠用胶带固定于创伤仪内制备伪创伤大鼠模型。1.1 Western Blot检测大鼠心肌组织GRP78、caspase-3、HDAC6、P300蛋白表达情况。1.2 Real-time PCR检测大鼠心肌组织GRP78、HDAC6、P300的m RNA水平。1.3免疫组化染色(IHC)检测大鼠心肌组织GRP78、HDMLN8237使用方法AC6、P300的表达水平。1.4免疫沉淀(IP)检测大鼠心肌组织GRP78乙酰化水平。1.5 TUNEL法染色检测大鼠心肌细胞凋亡水平。2.离体水平:2.1高糖培养基(10%胎牛血清)培养H9C2心肌细胞,并以此作为对照组。使用创伤后12 h的大鼠血清代替胎牛血清进行细胞培养,以此作为创伤组,培养6 h、12 h、24 h。通过上述实验确定创伤最明显时间点。2.1.1 Western Blot检测H9C2心肌细胞caspase-3蛋白表达情况。2.1.2流式检测H9C2心肌细胞凋亡情况。2.2创伤组心肌细胞分别用0.5μM Trichostatin A和10μM ITSA-1培养24 h(创伤最明显)。分为正常血清组(N)、创伤血清组(T)、Trichostatin A组(T+TSA)、ITSA-1组(T+ITSA)。2.2.1 IP检测H9C2心肌细胞GRP78乙酰advance meditation化水平。2.2.2流式检测H9C2心肌细胞凋亡情况。2.2.3 Western Blot检测H9C2心肌细胞caspase-3、GRP78蛋白表达情况。2.2.4免疫荧光(IF)检测H9C2心肌细胞caspase-3、GRP78的表达水平。2.2.5 Real-time PCR检测H9C2心肌细胞GRP78的m RNA水平。结果:1.长时程ERS诱导的创伤性心肌细胞凋亡与GRP78表达及乙酰化水平相关。1.1大鼠心肌组织GRP78表达在创伤后6 h显著升高。Western blot结果表明,大鼠心肌组织GRP78表达在创伤后3 h蛋白开始升高,6 h达最高水平(P<0.05),IHC染色阳性点亦在6 h时出现最多(P<0.05),Real-time PCR结果显示GRP78 m RNA表达在创伤后3 h显著升高(P<0.05),6 h达峰值(P<0.05)。1.2大鼠心肌组织中GRP78乙酰化水平在创伤后6 h、12 h明显升高。IP显示,心肌组织GRP78乙酰化水平在创伤后6 h和12 h明显升高(P<0.05)。1.3大鼠心肌组织在创伤后6 h、12 h出现明显凋亡。Western blot结果表明,Caspase-3蛋白表达在创伤后12 h达峰值,TUNEL染色阳性点亦在12 h时出现最多(P<0.05)。2.ERS过程中存在HAT和HDAC的动态平衡。2.1 HDAC6表达在创伤后3 h升高,随之降低。Western blot结果显示,创伤大鼠心肌组织HDAC6的蛋白表达水平在创伤后3h出现高峰(P<0.05),IHC染色结果出现同样的现象(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,心肌组织HDAC6 m RNA表达水平在创伤后即刻开始升高,3 h出现高峰(P<0.05)。2.2 P300表达在创伤后6 h、12 h明显升高。Western blot和IHC染色结果表明,创伤大鼠心肌组织P300的蛋白表达在创伤后6 h和12 h显著升高(P<0.05),P300 m RNA表达在6 h达高峰(P<0.05)。2.3 HDAC6和P300表达随着创伤时间的延长出现此消彼长的趋势。Western blot和IHC染色结果表明,HDAC6表达在创伤后3 h升高,6 h、12 h明显降低(P<0.05);P300表达在创伤后6 h、12 h达最高峰值(P<0.05)。由此可见,随着时间推移,HDAC6和P300表达出现此消彼长的趋势。3.抑制HDAC功能可通过升高GRP78乙酰化水平导致创伤心肌细胞凋亡增加。3.1创伤血清培养H9C2心肌细胞24 h后凋亡最为明显。采用创伤大鼠血清培养H9C2细胞成功制备离体心肌创伤模型。Western blot结果显示,培养24 h后心肌细胞凋亡最为明显(P<0.05),流式结果显示,早期凋亡细胞显著增加。3.2抑制HDAC可使GRP78乙酰化水平明显升高。IP分析显示,HDAC抑制剂Trichostatin A(TSA)组GRP78乙酰化水平显著升高(P<0.05),而HDAC激动剂ITSA-1组GRP78乙酰化水平降低(P<0.05)。3.3抑制HDAC可使H9C2心肌细胞凋亡明显增加。流式分析发现,TSA组早期凋亡细胞占细胞总数的一半以上(73%),而ITSA-1组细胞凋亡水平较创伤组有所下降(6.6%)。Western blot和IF染色显示,TSA组Caspase-3表达水平显著高于对照组(P<0.05)。4.GRDS-3201体内实验剂量P78乙酰化水平的升高降低GRP78蛋白表达但不影响其m RNA的表达。Western blot结果显示,TSA抑制HDAC功能后,GRP78乙酰化水平的升高导致GRP78蛋白表达水平显著降低(P<0.05),IF染色阳性细胞数也显著降低(P<0.05)。Real-time PCR结果显示,TSA抑制HDAC功能后,在GRP78乙酰化水平的升高的情况下,GRP78 m RNA的表达未见明显变化(P>0.05)。结论:创伤后随着ERS时间的延长,GRP78乙酰化水平的升高可促进心肌细胞凋亡;且GRP78蛋白表达水平的降低可能与其乙酰化水平的升高有关,但不影响其转录水平。