当前,心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)的发病率和死亡率依然持续增长,严重危害人类生命健康。急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是最为常见和严重的心血管疾病,AMI会导致心肌细胞坏死从而影响心功能,虽然在临床中可以通过冠状动脉搭桥术、经皮冠状动脉介入术以及药物等治疗方法改善心肌梗死的预后,但还不能修复与再生受损的心肌。干细胞因具有多向分化潜能、自我更新能力等特性,为再生修复梗死心肌、逆转心肌损伤提供了新的思路。干细胞作为人体组织器官再生的基本生物学要素之一,其应用于修复损伤组织器官的治疗方法越来越受到重视,其中骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有易培养、强大的可塑性、低免疫原性等特点而成为研究的热点,BMSCs在恰当的诱导条件下可向心肌细胞或心肌样细胞分化,获得心肌样表型。然而在临床中存在移植BMSCs后分化效果不佳的问题,因此选择合适的诱导剂变得极其重要。近年来,白藜芦醇因对心血管系统的保护作用而备受关注,作为一种更多由植物产生的多酚类化合物,白藜芦醇表现出多种生物活性,包括抑制心肌损伤、抗心肌纤维化以及抗炎等作用。然而白藜芦醇浓度过高也可抑制BMSCs的细胞活性。已有研究发现,适当浓度的白藜芦醇可以促进胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)和诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)向心肌细胞分化,以提高向心肌细胞分化效率。本实验应用不同浓度的白藜芦醇体外诱导BMSCs,从多方面探究白藜芦醇是否可以促进BMSCs分化为心肌样细胞,以及白藜芦醇的最适诱导浓度,同时探究白藜芦醇促进BMSCs分化为心肌样细胞的可能机制,为提高BMSCs诱导分化率提供实验依据,为患者的个性化治疗提供理论支持。为了探讨白藜芦醇诱导BMSCs向心肌样细胞分化的可行性以及可能机制,本实验采用全骨髓贴壁法提取大鼠骨髓细胞;运用流式细胞术鉴定第3代BMSCs表面抗原;采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测5,10,20,50,100,200μmol·L-1白藜芦醇对BMSCs细胞活力的影响;运用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)法检测不同浓度白藜芦醇诱导BMSCs后1w,2w和4w的GATA-4,Nkx2.5 m RNA表达情况;采用免疫细胞化学染色检测诱导4w后的各组细胞间隙连接蛋白(connexin 43,Cx43)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,c Tn T)、心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,c Tn I)的表达情况;运用免疫印迹(Western Blot)检测诱导4w后各组细胞结蛋白(Desmin),c Tn T的表达情况;将细胞分为对照组、10μmol·L-1白藜芦醇组、10μmol·L-1白藜芦醇+氯化锂(Lithium chloride,Li Cl)组,Western Blot检测各组Wnt/β-catenin信号通路中p-β-catenin/β-catenin的变化。倒置相差显微镜下观察培养过程中BMSCs形态变化,细胞形态由初期的圆形,逐渐变为三角形、短梭形、不规则形以及长梭形。经10μmol·L-1白藜芦醇诱导后,梭形细胞减少,可见三角形和不规则形细胞,随后细胞间出现细胞连接,部分细胞形态为长柱形或多边形,细胞排列较为紧密,具有方向性,不同浓度白藜芦醇诱导的BMSCs的形态无显著差异。流式细胞术结果示:CD29,CD90的阳genetic accommodation性表达率分别为91%和95%,CD45的阳AZD2281性表达率为2.4%。CCK-8结果示:50,100,200μmol·L-1白藜芦醇抑制BMSCs的细胞活力,5,10,20μmol·L-1白藜芦醇对BMSCs细胞活力无影响,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-q PCR结果示:5,20μmol·L-1白藜芦醇组GATA-4基因相对表达量在4w时最强,而10μmol·L-1白藜芦醇组在2w时表达达高峰,以诱导后2w为时间点,10μmol·L-1白藜芦醇组显著高于其余各组,差异具有统计学意义(P<0.05)。5μmol·L-1白藜芦醇组在不同时间点Nkx2.5基因的相对表达量均较弱,而10μmol·L-1白藜芦醇组随时间增加Nkx2.5基因表达呈上升趋势。以诱导后4w为时间点,10μmol·L-1白藜芦醇组显著高于其余各组,差异具有统计学意义(P<0.05)。免疫细胞化学染色结果显示:各浓度的诱导组Cx43,c Tn T,c Tn I均呈阳性表达,10μmol·L-1的白藜芦醇组阳性表达最高,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果示:5,20μmol·L-1白藜芦醇组Desmin蛋白的表达与对照组相比无显著差异,而10μmol·L-1白藜芦醇组Desmin蛋白的表达高于对照组(P<0.05);5,10,20μmol·L-1白藜芦醇组c Tn T蛋白表达均高于对照组,其中蛋白表达量最高的为10μmol·L-1白藜芦醇组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot检测p-β-catenin/β-catenin的变化,结果示:对照组和10μmol·L-1白藜芦醇+Li Cl组p-β-catenin/β-catenin低于10μmol·L-1白藜芦醇组,差异具有统计学意义(P<0.05)。以上实验结果说明白藜芦醇在一定条件下可以诱导BMSCs向心肌样细胞分化,其中10μmol·L-1可能为最佳诱导浓度。白藜芦醇可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白的表达促进BMSCs向心肌样细胞分化。