研究背景巨噬细胞(macrophages,MΦs)广泛存在于机体各个部位,具有吞噬和清除异物及衰老细胞的功能,并且在维持机体稳态、组织修复、再生及纤维化方面起到了重要的作用。MΦs具有高度可塑性及多样性,位于不同组织中的MΦs在外观和功能上均有差异。MΦs在多种肿瘤微环境中大量表达,在某些实体肿瘤中的比例高达50%。MΦs作为肿瘤微环境中最重要的免疫细胞群,有促进肿瘤发生发展的重要功能,主要功能包括:(1)肿瘤的发生、发展;(2)侵袭转移;(3)血管生成;(4)免疫抑制;(5)肿瘤耐药。我们课题组的前期研究发现,MΦs在多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)微环境中大量存在,并能够保护MM免受化疗药物引起的细胞凋亡。虽然一些研究也证实了MΦs在介导肿瘤耐药中的作用,但MΦs在介导肿瘤耐药中的具体分子机制尚不明确,其潜在机制值得进一步研究。白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种免疫抑制细胞因子,是细胞因子IL-10家族的创始成员。几乎所有的白细胞亚群都能产生IL-10,包括先天免疫系统中的MΦs、单核细胞和自然杀伤细胞等,以及适应性免疫系统中的CD4~+T细胞、CD8~+T细胞和B细胞等。IL-10是一种多效能的细胞因子,具有限制过度炎症反应、促进组织修复、调节先天免疫和适应性免疫反应等功能,在维持组织稳态,尤其是感染和炎症过程中发挥了重要作用。IL-10广泛存在于多种肿瘤的微环境中,但IL-10在不同肿瘤中的作用似乎是矛盾的。IL-10VP-16说明书作为一种免疫抑制细胞因子,可以通过下调肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫反应来增强肿瘤免疫逃逸,进而起到促进肿瘤生长和侵袭的作用。而其他研究结果却与之相反,认为IL-10有助于抑制并消除血管生成及肿瘤转移。MΦs,尤其是肿瘤相关MΦs(tumor-associated macrophages,TAMs),可以释放大量的IL-10。TAMs产生的IL-10可以通过抑制抗原提呈细胞的功能,进而阻断T细胞效应功能,从而削弱抗肿瘤反应。反之,IL-10能增加MΦs的募集并通过下调血管内皮生长因子的产生,抑制MΦs的活化,并且IL-10也能够抑制活化的MΦs中细胞因子的表达。然而,IL-10在MΦs介导的肿瘤耐药中的作用仍然未知。因此,针对肿瘤耐药,本研究另辟蹊径,以MΦs介导的肿瘤耐药为切入点,探索IL-10在MΦs介导的肿瘤耐药中的作用及可能机制,以期为克服肿瘤化疗耐药提供新的策略并为后续药物筛选提供新的途径。本研究主要分为以下四部分:第一部分IL-10在MΦs介导的肿瘤耐药中的作用目的:探究IL-10在MΦs介导的肿瘤耐药中的作用。方法:(1)取小鼠骨髓细胞,M-CSF诱导生成骨髓来源的MΦs,诱导过程中加入IL-10生成IL10-MΦs;将MΦs与IL10-MΦs分别与小鼠MM细胞系MPC-11或5TGM共培养,同时加入化疗药物硼替佐米(bortezomib,BTZ)或美法仑(melphalan,MEL);流式细胞术分析MM细胞的凋亡情况;(2)建立MPC-11荷瘤Balb/c小鼠模型,随机分组,分别给予化疗药物(BTZ或MEL)、IL-10中和抗体(Anti-IL10)、化疗药物联合Anti-IL10进行治疗,给予PBS的小鼠作为对照,监测肿瘤生长情况。结果:(1)与MΦs相比,IL10-MΦs减少了BTZ或MEL诱导的MM细胞凋亡;(2)与单独化疗组相比,化疗药物联合Anti-IL10组可以增强化疗药物对肿瘤生长的抑制。结论:IL-10促进MΦs介导的肿瘤化疗耐药。第二部分IL-10在MΦs脂肪酸代谢中的作用目的:探究IL-10在MΦs脂肪酸代谢中的作用。方法:(1)体外生成MΦs和IL10-MΦs,BODIPY 493/503染色;共聚焦显微镜观察细胞中的脂质含量并用流式分析仪对细胞中的脂含量进行定量检测;(2)使用脂肪酸摄取试剂盒,酶标仪检测MΦs及IL10-MΦs对外源性TF2-C12脂肪酸摄取强度;(3)利用XF棕榈酸氧化压力测试试剂盒,Seahorse XFe24仪检测MΦs及IL10-MΦs的线粒体耗氧率(oxygen consumption rates,OCR)。结果:(1)与MΦs相比,IL10-MΦs中的脂质含量明显增加;(2)与MΦs相比,IL10-MΦs对外源性脂肪酸的摄取明显增加;(3)MΦs和IL10-MΦs均以脂肪酸为底物进行β-氧化供能;与MΦs相比,IL10-MΦs的基础OCR和最大OCR均明显增加。结论:IL-10增强了MΦs脂质的摄取、积累及脂肪酸β-氧化。第三部分IL-10促进MΦs介导的肿瘤耐药的分子机制研究目的:探究IL-10促进MΦs介导的肿瘤耐药的分子机制。方法:(1)体外生成MΦs及IL10-MΦs,收集细胞进行转录组测序分析;(2)q PCR检测MΦs及IL10-MΦs中Fabp5的m RNA水平;Western blot检测MΦs及IL10-MΦs中FABP5的蛋白表达水平;(3)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入BMS309403(FABP5抑制剂,FABPi),生成的MΦs与MM细胞共培养,同时加入化疗药物BTZ或MEL;流式细胞术分析MM细胞的凋亡情况;(4)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入si-Fabp5;q PCR检测细胞中Fabp5的m RNQ-VD-Oph半抑制浓度A水平;Westen blot检测细胞中FABP5的蛋白表达水平;(5)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入si-Fabp5,生成的MΦs与MM细胞共培养,同时加入化疗药物BTZ;流式细胞术分析MM细胞的凋亡情况;(6)建立MPC-11荷瘤Balb/c小鼠模型,随机分组,分别给予化疗药物(BTZ或MEL)、FABPi、化疗药物联合FABPi进行治疗,给予PBS的小鼠作为对照,监测肿瘤生长情况。结果:(1)经分析比对IL10-MΦs与MΦs测序结果,共筛选出了21个与脂肪酸代谢相关的基因差异表达,其中Fabp5是上调表达差异最大、表达量最高的基因;(2)相比MΦs,IL10-MΦs中Fabp5显著高表达,并且FABP5蛋白水平明显升高;(3)FABPi处理的MΦs与MΦs相比,对于BTZ及MEL诱导的肿瘤细胞凋亡的影响无明显差异;而与IL10-MΦs相比,FABPi的加入削弱了IL-10对MΦs介导的MM耐药的促进作用;(4)MΦs敲低Fabp5(si-Fabp5)与对照组(si-CT)相比,对BTZ诱导的MM细胞凋亡的影响无明显差异,但在IL10-MΦs中,与对照组相比,敲低Fabp5后几乎完全消除了IL-10对MΦs介导的肿瘤耐药的促进作用;(5)相比PBS处理组,化疗药(BTZ或MEL)能够明显的抑制肿瘤生长,而FABPi对肿瘤生长的抑制作用不显著;但与化疗药组相比,化疗药物与FABPi联合能够显著增强化疗药对肿瘤的抑制作用。结论:IL-10通过上调FABP5促进了MΦs介导的肿瘤耐药,靶向FABP5可以增强体内MM的化疗效果。第四部分IL-10促进MΦs介导的肿瘤耐药的信号通路研究目的:探究IL-10促进MΦs介导的肿瘤耐药的信号通路。方法:(1)诱导IL10-MΦs的过程中加入FABPi;收集细胞(IL10-MΦs和FABPi/IL10-MΦs)进行转录组测序分析;(2)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入依托莫司(CPT1A抑制剂,CPT1Ai);生成的MΦs与MM细胞共培养,同时加入化疗药物BTZ或MEL;流式细胞术分析MM细胞的凋亡情况;(3)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入GW9662(PPARγ抑制剂,PPARi);q PCR检测MΦs中Fabp5的m RNA水平;Westen blot检测MΦs中FABP5蛋白表达水平;(4)诱导MΦs及IL10-MΦs的过程中加入PPARi;生成的MΦs与MM细胞共培养,同时加入化疗药物BTZ或MEL;流式细胞术分析MM细胞的凋亡情况。结果:(1)与IL10-MΦs相比,加入FABPi后,共筛选出了40个与脂肪酸代谢相关的差异表达基因,其中Cpt1a在FABPi/IL10-MΦs中表达下调;(2)CPT1Ai处理的MΦs与MΦs相比,对于化疗药(BTZ及MEL)诱导的肿瘤细胞凋亡的影响无明显差异;而与IL10-MΦs相比,加入CPT1Ai后,ILbioactive glass10-MΦs降低化疗药诱导MM凋亡的作用减弱;(3)PPARi抑制了MΦs中Fabp5的表达并且完全消除了IL-10促使的MΦs中Fabp5的过表达;PPARi降低了IL-10对MΦs中FABP5蛋白表达的促进作用;(4)PPARi处理的MΦs与MΦs相比,对于化疗药诱导的MM凋亡的影响无明显差异;而与IL10-MΦs相比,加入PPARi后,IL-10促进MΦs介导的肿瘤耐药的作用完全被消除。结论:IL-10通过PPARγ-FABP5-CPT1A信号途径促进MΦs介导的肿瘤耐药。