研究目的:本研究采用博来霉素构建肺纤维化大鼠模型,利用现代分子生物学实验技术,围绕miR-146/NF-κB信号通路,深入探讨雷公藤多苷(TWP)对肺纤维化大鼠的干预机制,为TWP在肺纤维化中的临床应用提供理论基础与实验依据。研究方法:将40只SD大鼠随机选取6只作为空白组,剩余34只大鼠均采用博来霉素诱导肺纤维化模型,造模后7d剔除死亡4只,将剩余30只大鼠分为模型组、醋酸泼尼松组、雷公藤多苷低(L-TWP)、中(M-TMedicine Chinese traditionalWP)、高(H-TWP)剂量组。TWP各组给药剂量分别为1mg/kg·d(L-TWP组)、3mg/kg·d(M-TWP组),6mg/kg·d(H-TWP组),醋酸泼尼松组给予醋酸泼尼松片1.17mg/kg·d灌胃,空白组和模型组分别给予相同剂量的生理盐水灌胃,1次/d,连续给药21d,在第28d将全部大鼠处死,同时进行标本采集。第一部分:大鼠肺纤维化模型构建及TWP对大鼠肺组织形态和病理学的影响1.观察大鼠的一般表征情况和肺组织形态学,根据大鼠肺湿重和体质量计算肺系数;2.将肺组织进行石蜡包埋切片,通过HE、Masson染色结果,观察大鼠肺组织形态及病理学改变,通过纤维化评分结果,评估大鼠肺纤维化严重程度。第二部分:TWP对miR-146/NF-κB信号通路和肺纤维化大鼠免疫调控的影响1.用Elisa检测各组大鼠血清中HYP、TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ和IL-4的含量。2.用RT-qPCR检测各组大鼠肺组织中miR-146a、Col-I、NF-κB和TGF-β1的基因表达量。3.用Western Blot对各组大鼠肺组织中NF-κB、IRAK1、TRAF6、TGF-β1和α-SMA蛋白表达进行定量检测。研究结果:第一部分:1.(1)大鼠一般表征:造模后,空白组大鼠整体状态较好,活动灵敏,饮食饮水尚可,皮毛色泽光亮,体重均逐渐增加。模型组大鼠整体状态较差,喜抱团蜷缩,聚集于鼠笼角落,皮毛杂乱,色泽暗淡,气促喘息,少许口鼻出血,体重增长缓慢,7d内陆续死亡4只。药物干预后,模型组大鼠状态整体较前更差,体型消瘦,精神不振,活动度下降,不同程度出现摄食饮水变少,体重增加缓慢等情况。其余4组大鼠整体状态逐渐有所改善,精神尚可,体重开始增长,总体以M-TWP组、H-TWP组状态最佳。(2)肺组织情况:空白组大鼠双肺红润,大小正常,弹性良好,无陈旧性出血点。模型组大鼠双肺呈暗红色,体积缩小,表面粗糙,可见不同程度的结节样、条索状和凹沟样苍白灶,质地较硬,弹性差,局部可见陈旧性出血点。与模型组相比,醋酸泼尼松组和TWP各组大鼠在肺组织色泽、弹性、质地等方面都有一定程度改善,以M-TWP组、H-TWP两组改善效果最为显著,醋酸泼尼松组略好于L-TWP组。(3)肺系数:与空白组比较,模型组大鼠肺系数显著升高(P<0.01);与模型组比较,醋酸泼尼松组及TWP各剂量组大鼠肺系数均有不同程度减低(P<0.01);其中,L-TWP组、M-TWP组和醋酸泼尼松组相比差异不明显(P>0.05),H-TWP与醋酸泼尼松组之间差异具有显著统计学意义(P<0.01)。2.肺组织病理学情况:HE染色和Masson染色结果显示,空白组大鼠肺组织结构完整,无明显病理学变化和纤维化灶。模型组大鼠可见肺组织结构破坏、肺泡间隙增厚、胶原沉积等病理学改变,大量纤维化灶形成,纤维化评分显著升高(P<0.01);醋酸泼尼松组和TWP各剂量组肺泡组织结构、炎性细胞浸润均有不同改善,纤维化程度也有所减轻,且M-TWP组、H-TWP组评分显著低于醋酸泼尼松组(P<0.05),L-TWP组与醋酸泼尼松组未见明显差异(P>0.05)。第二部分:1.Elisa检测结果:(1)各组大鼠血清中炎性因子水平表达情况:与空白组比较,模型组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,醋酸泼尼松组和TWP各剂量组TNF-α、IL-6、IL-1β表达水平均有不同程度下降(P<0.05或P<0.01)。其中,L-TWP组TNF-α、IL-6表达均高于醋酸泼尼松组(P<0.01),IL-1β表达水平则无明显差异(P>0.05);M-TWP组和H-TWP组TNF-α、IL-6、IL-1β表达显著降低,均低于醋酸泼尼松组(P<0.01)。(2)各组大鼠血清中HYP因子水平表达情况:与空白组比较,模型组大鼠血清内HYP水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,醋酸泼尼松组、TWP各剂量组大鼠血清内HYP水平均有显著的下降(P<0.01)。其中,M-TWP组和H-TWP组HYP水平均明显低于醋酸泼尼松组(P<0.01),L-TWP组与醋酸泼尼松组相比未见明显差别(P>0.05)。(3)各组大鼠血清中IFN-γ、IL-4因子水平比较:与空白组比较,模型组大鼠血清中IFN-γ表达显著降低(P<0.01),IL-4表达显著升高(P<0.01),IFN-γ/IL-4降低(P<0.01);与模型组比较,醋酸泼尼松组和TWP各剂量组大鼠血清中IFN-γ表达均显著升高(P<0.01),IL-4表达显著降低(P<0.01),IFN-γ/IL-4升高(P<0.01);其中,M-TWP组和H-TWP组与醋酸泼尼松组相比,大鼠血清中IFN-γ表达均显著升高(P<0.01),IL-4表达显著降低(P<0.01),IFN-γ/IL-4升高(P<0.01);L-TWP组IFN-γ表达与醋酸泼尼松组未见明显差异(P>0.05),IL-4表达则高于醋酸泼尼松组(P<0.01),IFN-γ/IL-4降低(P<0.01)。2.RT-qPCR检测结果:与空白组相比,模型组大购买Tamoxifen鼠肺组织中miR-146a的表达显著降低(P<0.01),NF-κB、TGF-β1、Col-Ⅰ表达趋势与miR-146a相反,呈显著上升趋势(P<0.01);与模型组比,醋酸泼尼松组与TWP各剂量组大鼠肺组织中miR-146a表达逐渐升高(P<0.01),NF-κB、TGF-β1、Col-Ⅰ均有不同程度降低(P<0.05或P<0.01);与醋酸泼尼松组相比,M-TWP组和H-TWP组miR-146a表达显著上升(P<0.01),NF-κB、TGF-β1、Col-Ⅰ表达水平显著下降Captisol体外(P<0.05或P<0.01),各基因表达量在L-TWP组与醋酸泼尼松之间未见明显差异(P>0.05)。3.Wb检测结果:与空白组相比,模型组大鼠肺组织内NF-κB、IRAK1、TRAF6、TGF-β1和α-SMA的表达水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,醋酸泼尼松组和TWP各剂量组NF-κB、IRAK1表达水平均有不同程度的降低(P<0.05或P<0.01);TRAF6、TGF-β1和α-SMA表达水平在M-TWP组和H-TWP组显著降低(P<0.05或P<0.01),在醋酸泼尼松组和L-TWP组未见明显差异(P>0.05)。H-TWP组各蛋白表达水平显著低于醋酸泼尼松组(P<0.05或P<0.01)。研究结论:TWP可通过上调miR-146a表达抑制其靶基因表达,从而阻断NF-κB信号通路的激活以及下游炎症因子的释放,以达到抗炎和免疫调节作用,此过程中减缓了大鼠肺组织中ECM的过度合成,有效改善了胶原蛋白积聚,延缓肺纤维化进程。