血小板功能障碍是脑梗死(Cerebral infarction,CI)发生发展的主要病理基础,抗血小板治疗一直是防治CI的重要举措。P2Y12受体在CI中扮演多种角色,激活P2Y12会触发血小板活化和聚集,进一步引起血栓炎症,扩大梗死面积,加重CI病理损伤。因此,长期以来血小板P2Y12受体一直是抗血小板药物的主要靶标,血小板P2Y12拮抗剂如氯吡格雷应用广泛。然而,P2Y12拮抗剂在临床应用当中时有出血、梗死后复发、药物抵抗等副作用,安全性及有效性的共同发挥,成为当前血栓性疾病防治的重难题。活血化瘀类传统药物因其多靶点、多效应和多通路的协同效应,日渐成为中医药研究的焦点,前景广阔。血瘀证是指体内血流不畅,经脉受阻,血液瘀滞所引起的证候,在中医心脑血管病中最为常见,但临床发病具有多证夹杂的普遍特点,其中以气虚血瘀证致病最广。补阳还五汤(Buyang Huanwu decoction,BYHW)以“气血之荣枯、经络之通滞”立方,是治疗CI气虚血瘀证的经典名方。既往研究表明,BYHW具有抑制血小板活化、抗炎症因子表达的作用。针对CI气虚血瘀证患者血小板的具体改变及是否存在差异表达基因,同时,有明确临床疗效的活血化瘀类中药复方BYHW,又能否对P2Y12受体和相关的信号传导途径进行调控,从而起到抗血小板活化聚集的作用,目前尚不明确,亟待结合临床与基础实验进一步挖掘探讨。第一部分基于CiteSpace和VOSviewer对血小板在脑梗死研究领域的国内外文献计量学分析目的:通过对近10年国内外CI领域血小板相关文献研究进行可视化分析,宏观挖掘该领域热门研究及前沿方向。方法:通过检索近10年CNKI及WOS中、英文数据库,分别获得中、英文文献数据源。利用CiteSpace获取网络可视化(研究机构、作者、参考文献)的地图,聚类分析和时间线可视化分析(关键词)和引用突发(参考文献、关键词),包括期刊的双映射图谱(dual-map);采用VOSviewer获取网络可视化(国家/地区、关键词)地图,年份叠加可视化(国家/地区、关键词)地图,密度可视化(国家/地区、关键词)地图。结果:(1)根据检索策略,共筛选收录1974篇文献。有关CI中血小板研究的文献数量呈现爬坡式稳定增涨的整体趋势。(2)这些中、英文出版物主要来自中国和美国,尤以中国学者的贡献量最大。(3)主要研究机构为吉林大学、河北医科大学、Capital Med University、Wurzburg University。(4)中国实用神经疾病杂志、中国医药指南、CIRCULATION和NEW ENGL J MED是研究最多的期刊和共同引用的期刊。(5)研究作者中,来自首都医科大学附属北京天坛医院王拥军、德阳市人民医院的易兴阳、维尔茨堡大学的Bernhard Nieswandt和Guido Stoll,其出版物数量排名靠前。(6)关键BIBW2992分子量词中,中、英文文献最强引用突现分别为氯吡格雷、预防、不良反应、机械取栓以及intravenous thromboly sis、thrombectomy、neutrophil extracellular traps 等;聚类分析形成#0 氯吡格雷,#1卒中.#2脑梗死,#3心房颤动,#4血小板,#5抗血小板,#6二级预防以及#0 ischemic cerebral infarction,#1 Clopidogrel,#2 acute ischemic stroke,#3 pl atelet activation#4 atrial fibrillation,#5 eicosanoic acids 等簇集圈;时间轴上最新的聚类关键词为神经因子、神经功能恢复、炎症指标、降纤治疗、二级预防、脑血流量、免疫功能、预测价值以及early management、dual anti-platelet therap y、cell death、cerebral venous thrombosis、intracerebral hemorrhage、predicts 等。结论:近10年国内外CI中血小板的研究主要集中在抗血小板药物、血小板功能、取栓、早期管理及二级预防、预测、神经细胞修复、免疫炎症、生物标志物和生物组学技术等方面,作为本领域的研究热门及前沿方向。第二部分脑梗死气虚血瘀证患者血小板功能及形态变化的临床研究目的:基于临床研究,观察CI气虚血瘀证患者血小板相关生物学指标及微观形态变化。方法:采用临床横断面研究,纳入符合标准的CI气虚血瘀证研究组和健康对照组受试者,比较两组受试者血小板的最大聚集率、凝血功能、基础参数等临床生物学指标;采用流式细胞术检测血小板活化指标CD62P、PAC-1及12项炎性细胞因子,观察血小板活化程度及炎性反应;运用透射电镜观察血小板沉淀物的微观形态变化。结果:(1)研究组气虚血瘀证候平均积分34.55±3.95分;研究组NIHSS平均积分为10.87±3.86 分;研究组 TG(t=3.17,P<0.01)、GGT(t=2.39,P-0.0187)、GLU(t=3.74,P<0.01)、UA(t=2.77,P<0.01)明显高于对照组。(2)血小板聚集率指标中,研究组PAg-AA、PAg-ADP、PAg-COL明显高于对照组(tPAg-AA=3.213,P<0.01;tPAg-ADP=7.682,P<0.01;tPAg-COL=2.766,P<0.01);凝血功能指标中,研究组APTT、TT明显低于对照组(tAPTT=2.22,P<0.05;tTT=2.57,P<0.05),研究组FIB显著高于对照组(tFIB=3.15,P<0.01);血小板参数指标中,研究组PLT、PCT明显低于对照组(tPLT=2.27,P<0.05;tPCT=3.10,P<0.01)。(3)流式细胞术结果表明,与对照组相比,研究组血小板活化指标C D62P、PAC-1表达水平呈现显著升高(P<0.01)。(4)与对照组相比,研究组血清中炎性因子IL-4、IL-8表达水平降低(P<0.01,P<0.01);而IL-5、IL-10、IFN-γ表达水平升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。(5)透射电镜显示,对照组血小板呈椭圆形,细胞膜边界清晰,血小板内颗粒清晰可见,细胞结构完整。CI气虚血瘀证研究组患者的血小板细胞膜破损,出现大面积空泡现象,细胞内颗粒破坏程度高,线粒体峭出现断裂,细胞结构紊乱,同时有伪足伸出倾向。结论:CI气虚血瘀证患者血小板结构破损明显,存在高度血小板活化聚集及凝血功能障碍,同时伴有炎性反应。第三部分脑梗死气虚血瘀证病证严重程度与血小板生物学指标的相关性及预测价值目的:探索CI气虚血瘀证患者病证严重程度与血小板生物学指标的相关性,挖掘CI气虚血瘀证发生的临床预测指标。方法:应用一般线性双变量Pearson直线相关性检验血小板聚集率、凝血功能、血小板参数等临床血小板生物学相关指标与气虚血瘀证候(QDBSS积分)、神经功能缺损(NIHSS评分)的相关性;采用二元Logistic回归(Enter法)分析气虚血瘀证候及神经功能缺损严重程度的独立影响因素;通过生存曲线(ROC)检验各指标水平预测气虚血瘀证候及神经功能重度缺损的临床价值。结果:(1)QDBSS积分与NIHSS评分(r=0.786,P<0.01)存在直线正相关性,其直线回归方程为Y=19.29+1.43X。(2)气虚血瘀证严重程度与PAg-A A(r=0.448,P=0.013)、FIB(r=0=0.362,P=0.008)呈正相关,与 APTT(r=-0.331,P=0.015)呈负相关;神经功能缺损程度与PAg-AA(r=0.420,P=0.021)、PAg-A DP(r=0.528,P=0.005)、FIB(r=0.276,P=0.047)呈正相关,与 APTT(r=-0.338,P=0.013)呈负相关(P<0.05)。(3)PAg-ADP(OR=1.306,95%CI 1.014～1.684,P=0.039)、FIB(OR=17.749,95%CI 1.834～17.178,P=0.013)、PLT(OR=0.760,95%CI 0.617～0.936,P=0.010)、PCT(OR=5.920,95%CI 4.027～8.703,P=0.015)、PDW(OR=12.645,95%CI 1.322～12.092,P=0.028)指标是 CI 气虚血瘀证证候严重程度的独立影响因素。(4)PAg-ADP(OR=1.589,95%CI 1.076～2.348,P=0.020)、TT(OR=8.711,95%CI 1.204～63.010.P=0.032)、FIB(OR=7.216,95%CI 1.135～45.870,P=0.036)、PLT(OR=0.739,95%CI 0.581～0.940,P=0.014)、PCT(OR=5.832,95%CI 8.631～3.940,P=0.020)指标是CAutoimmune kidney diseaseI气虚血瘀证神经功能缺损严重程度的独立影响因素。(5)PAg-ADP、FIB、PLT、PCT用于预测CI气虚血瘀证的AUC分别为0.9310、0.7196、0.6273、0.6608,均有一定预测价值,以PAg-ADP及FIB预测价值最显著。结论:CI气虚血瘀证存在血小板聚集及凝血功能异常,PAg-ADP、FIB水平是影响病证严重程度的共同独立危险因素,临床相关性突出,长期监测对疾病的预后和转归具有重要意义和评估价值。第四部分脑梗死气虚血瘀证患者的血小板转录组学分析目的:寻找CI气虚血瘀证与健康人群之间的差异表达基因,揭示导致CI气虚血瘀证发生的分子机制,为临床研究和基础实验提供证据链。方法:分别采集研究组和对照组肘静脉血并分离血小板,进行总RNA提取,检测血小板沉淀物的总RNA,建立转录组学文库,使用Illumina HiSeqTM 2500测序仪进行测序,通过GO富集、KEGG富集及蛋白互作网络分析,挖掘CI气虚血瘀证患者血小板的差异表达基因和相关信号通路,并进行RT-qPCR验证。结果:(1)两组间差异表达基因共2253个,上调的基因有1731个,下调的基因有522个。(2)两组间GO富集总条目5492条,其中BP类别3790个,CC类别656个,MF类别1046个。差异表达基因主要富集在extracellular exos ome(细胞外外泌体)、neutrophil degranulation(中性粒细胞脱颗粒)、platelet degranulation(血小板脱颗粒)、blood coagulation(血液凝固)、inflammator y response(炎症反应)、nucleosome assembly(核糖体组装)、platelet alpha granule lumen(血小板α颗粒腔)、focal adhesion(黏着斑)、tertiary granule 1 umen(三级颗粒管腔)、platelet aggregation(血小板聚集)、platelet activation(血小板活化)等。(3)两组间KEGG富集总条目319条,其中HD类别91个,OS类别82个,CP类别21个,EIP类别32个,GIP类别19个,M类别74个。差异表达基因富集的主要途径为Gap junction(缝隙链接)、Focal adhe sion(黏着斑)、Necroptosis(坏死吞噬作用)、Rap1 signaling pathway(Rapl信号通路)、PI3K-Akt signaling pathway(P13K-Akt 信号通路)、IL-17 signali ng pathway(IL-17 信号传导通路)、NF-kappa B signaling pathway(NF-kappa B 信号途径)、Toll-like receptor signaling pathway(Toll 样受体信号通路)、NOD-like receptor signaling pathway(NOD 样受体信号通路)、Fluid shear str ess and atherosclerosis(流体剪切应力和动脉硬化)、Platelet activation(血小板激活)、Vascular smooth muscle contraction(血管平滑肌收缩)、Human cyto megalovirus infection(人类巨细胞病毒感染)等。(4)通过RT-qPCR验证发现,与对照组相比,CI气虚血瘀证患者血小板中的关键枢纽mRNA(GP1BA、GP1B B、VWF、IGF2、ITGA2B)及差异表达的 P2Y 受体家族 mRNA(P2RY1、P2R Y2、P2RY10、P2RY12、P2RY13、P2RY14)的表达趋势与 RNA-seq 结果趋势一致,说明RNA-seq的测序结果准确可信。结论:CI气虚血瘀证患者血小板中存在异常表达的mRNA表达谱,P2Y受体家族表达的mRNA可能参与CI气虚血瘀证血小板病理改变的发生。第五部分脑梗死气虚血瘀证病证结合模型大鼠的病理改变及补阳还五汤的作用研究目的:观察CI气虚血瘀证病证结合模型大鼠的病理改变,以及通过BYHW干预后的作用影响。方法:90只SD大鼠自由喂养3天,先睡眠剥夺2周,通过微球诱导多发性脑梗模型,结合水平台不完全睡眠剥夺法建立气虚血瘀证候,共同构建CI气虚血瘀病症相结合的动物模型,给予相应药物治疗1个月后采集标本。随机数字法将大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(Model)、氯吡格雷阳性药组(CL,6.75g/kg/d)、ADP 激动剂组(ADP,0.5ml 生理盐水稀释 0.2mg/kg ADPβS,尾静脉注射)、补阳还五汤高剂量组(BYHW-H,1.8g/kg/d)、补阳还五汤低剂量组(BYHW-L,0.9g/kg/d),每组15只。日常监测大鼠一般表征,造模术后6h及24h进行神经功能缺损评分,并于造模前、术后7天、14天、28天四个时间点称重后采用大鼠抓力测定仪记录最大抓力值;PeriCam PSI HR激光散斑血流视频监测大鼠尾部末梢循环血流灌注情况;利用HE染色观察脑组织海马区病理改变情况。结果:(1)Model组较Sham组大鼠体型消瘦,肢体偏瘫,反应迟钝,毛发枯黄无光泽;BYHW组大鼠状态稍好,体型发育相对正常。(2)造模前至第7天Model组较Sham组大鼠体重变化差异不显;第14天Model组较Sham组大鼠的体重呈现下降趋势(P<0.01);第28天Model组较Sham组大鼠体重也出现降低(P<0.01),与Model组相比,CL、BYHW-H组体重趋势相对较高,同时期AD P组最低。(3)造模前各组大鼠最大抓力值差异不显;第7、14天Model组较Sham组大鼠抓力出现明显减轻(P<0.01),与Model组相比,BYHW-H组大鼠最大抓力值呈现升高趋势(P<0.05);第28天Model组较Sham组大鼠抓力则表现降低(P<0.01),与Model组相比,其他各给药组均相对升高,该时期以CL、BYH W-H组抓力值最高而BYHW-L、ADP组相对较低。(4)大鼠尾部表面红色像素点密集且显色度高,提示血流循环良好;Model组较Sham组红色像素点稀疏且显色度较低,血循环较差;与Model组相比,CL灌注量最高,BYHW-H次之,ADP组相对较低,提示BYHW-H组给药后尾部微血流灌注情况有所改善。(5)Model组大鼠在造模术后6h及24h的神经功能缺损评分均比Sham高(P<0.01);与Model组比较,各给药组间大鼠术后24h内神经功能缺损评分均低于Model组(P<0.05)。(6)镜下可见Model组较Sham组结构损伤明显,表现为海马CA 1区神经元排列稀疏且散乱,神经元水肿、变性,细胞层次明显减低,存在炎细胞淋巴细胞聚集团,且部分细胞可见空泡变性,有核固缩甚至坏死现象;与Mo del组相比,BYHW-H组结构变化相对较轻,病理改变少于其他给药组而接近S获悉更多 ham 组。结论:1.CI气虚血瘀证大鼠存在体弱乏力、末梢微循环障碍等症状,同时合并神经功能缺损及海马区病理结构破坏等改变;2.BYHW可改善CI气虚血瘀证大鼠的气虚血瘀证候严重程度,减轻神经功能缺损及病理损伤。第六部分基于AC/PKA信号通路观察BYHW在P2 Y12受体介导下对CI气虚血瘀证血小板及神经炎症的调节机制目的:探索在P2Y12受体介导下对CI气虚血瘀证血小板功能及神经系统病变的影响,并探索BYHW调控的机制所在。方法:60只SD大鼠通过随机数字法分为假手术组(Sham)、模型组(Mo del)、氯吡格雷阳性药组(CL,6.75g/kg/d)、ADP激动剂组(ADP,0.5ml生理盐水稀释0.2mg/kg ADPβS,尾静脉注射)、补阳还五汤组(BYHW,1.8g/kg/d),每组15只。采用免疫荧光双标共定位P2Y12与小胶质细胞Iba-1;Micro PET/CT扫描评估大鼠脑部TSPO炎性表达;流式细胞术检测血小板表面膜糖蛋白CD62P、CD61表达水平;采用PL-12型全自动血小板聚集仪检测血小板聚集率;血凝仪检测血液凝血功能;甘氨酸银染色观察脑组织神经原纤维缠结(NFT s)情况;透射电镜观察血小板及小胶质细胞微观形态;ELISA检测脑组织cAM P、cGMP水平;Morris水迷宫实验评估大鼠记忆认知能力;Western-Blot检测P 2Y12、AC、PKA、p-VASPser157 蛋白表达。结果:(1)免疫荧光双标结果表明P2Y12受体与小胶质细胞Iba-1出现共表达,并特异性表达在小胶质细胞上;与Sham组相比,Model组P2Y12表达明显增多,小胶质细胞活化显著;与Model组相比,CL组P2Y12表达量最低,BYHW组小胶质细胞活化程度最低。表明中药复方BYHW可以协同发挥减轻炎症反应,降低脑损害的优势。(2)Model组较Sham组TSPO表达量明显升高,于第7天达到峰值,后逐渐小幅度下降,并在第14天后趋于平稳;与Model组比较,BYHW组在第1天相差无几,同样在第7天出现峰值,但其表达量仍低于Model组,后出现较大幅度下降趋势,在第14天后趋于平稳。(3)Model组相比于Sham组而言,大鼠血小板CD62P、CD61表达水平明显升高(P<0.01);CL、BYHW组的大鼠血小板CD62P的表达水平比Model组有所降低(P<0.01)。表明BYHW均具有抑制血小板活化作用。(4)与Sham组相比,由ADP诱导剂诱导的Model组大鼠血小板最大、平均聚集率(MAR、AAR)均较Sham组明显升高(P<0.05);与Model组相比,BYHW组可明显降低由ADP诱导的CI气虚血瘀证大鼠血小板 MAR(P<0.05)和 AAR(P<0.05)。(5)与 Sham 组比较,Model 组大鼠 PLT 显著降低(P<0.05),PT、PTA、Fbg 明显增高(P<0.05,P<0.01,P<0.05)。与 Model组相比,BYHW组PLT增高(P<0.01),Fbg显示下降(P<0.05)。提示BYHW可以改善血小板活化聚集,增加PLT水平,同时降低CI气虚血瘀证大鼠的Fbg表达。(6)与Sham组比较,Model组大鼠脑组织中cAMP水平存在降低(P<0.01),cGMP水平则有升高趋势(P<0.01);与Model组比较,CL、BYHW组大鼠脑组织中cAMP水平有所升高(P<0.05),CL组大鼠脑组织中cGMP水平有所下降(P<0.05)。提示BYHW通过提高缺血后大鼠脑组织cAMP表达水平,从而促进神经再生。(7)与Sham组比较,Model组大鼠总行动轨迹距离显著增加(P<0.05),逃避潜伏期明显延长(P<0.01),平均速度显示下降趋势(P<0.01),穿越平台次数有所降低(P<0.01);BYHW组大鼠游泳总距离和逃避潜伏期时长均比Model组减少(P<0.05),而平台穿越次数有所增多(P<0.05)。表明BYHW可改善大鼠空间学习记忆能力。(8)甘氨酸银染色(镀银)染色镜下可观察Model组较Sham组大鼠海马区染色明显加重,镜下可见大量黑色条状染色,可见大量皱缩的神经元并且被染成深褐色,神经元轴突呈黑色并且形态较粗,尤其以CA3区最为明显;BYHW组大鼠海马区分布黑色条状染色相对较浅,黑色的神经元轴突分布有所减少。(9)大鼠血小板透射电镜观察发现,Model组较Sham组大鼠血小板黏附聚集成团,细胞结构严重破损,有伪足伸出倾向。BYHW组大鼠血小板微观结构改善明显,胞膜边缘比较完整,未见明显伪足。脑组织小胶质细胞超微结构观察发现,Model组较Sham组小胶质细胞破碎,细胞核呈不规则形,局部明显凹陷;CL、BYHW组小胶质细胞结构破坏程度较Model组减轻;ADP组则破坏明显。提示CI气虚血瘀证会出现小胶质细胞炎性表达提高,BYHW能减轻缺血后小胶质细胞损伤程度。(10)WB结果显示,与Sham组相比,Model组血小板P2Y12蛋白表达水平明显升高(P<0.01),AC、PKA、p-VASPser157蛋白表达降低(P<0.05,P<0.01,P<0.01),ADP 组 AC、PKA、p-VASPser157蛋白表达水平下降((P<0.01,P<0.05);与Model组比较,CL、BYHW组大鼠的血小板P2Y12蛋白表达水平均下降(P<0.05),同时AC、PKA、p-VASPser157蛋白含量不同程度升高(P<0.05)。表明BYHW能够提高CI气虚血瘀证血小板中AC、PKA蛋白表达水平,促进磷酸化的VASP(p-VASPSer157)去磷酸化,发挥抗血小板活化作用。结论:1.CI气虚血瘀证大鼠脑组织存在P2Y12与小胶质细胞Iba-1共表达,血小板活化、聚集水平明显增高,凝血功能障碍,电镜微观结构破损变形,同时脑组织出现炎性反应水平高表达,空间学习及认知记忆能力降低明显;2.BYHW可抑制P2Y12受体介导的血小板功能改变,并通过调控AC/PKA信号通路,提升p-VASPSer157蛋白表达抑制CI气虚血瘀证血小板的活化聚集;与西药P2Y12受体拮抗剂氯吡格雷相比,BYHW同时还可以协同发挥减轻神经炎性反应、改善神经功能损伤的作用。