随着人类社会的不断进步,以及肥胖、糖尿病、癌症等多种因素的共同影响,高血脂已逐渐引起人类的高度关注,其主要特征是血脂代谢异常,严重威胁着人类的生命安全。此外,有研究表明胆固醇失衡可能会导致心血管疾病(Cardiovascular diseases,CVD),或与阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)以及多种癌症等疾病相关。患者可以通过调节饮食与加强锻炼,并服用一些降血脂药物来调节体内胆固醇水平从而治疗高脂血症及相关疾病。胆固醇代谢的稳态对维持细胞生理功能具有重大意义。研究表明肿瘤细胞中代谢异常会对细胞迁移、增殖等能力产生影响,这也为通过调控胆固醇代谢进而治疗癌症提供新的启发。由于人体内80%左右的胆固醇是由人体自身合成的,所以目前大部分降血脂药物的研发思路为抑制胆固醇的内源性合成。24-脱氢胆固醇还原酶(3β-hydroxysterol△24-reductase,DHCR24),是胆固醇生物合成途径中的关键酶,作用是催化链甾醇还原为胆固醇,因而理论上可以通过抑制DHCR24蛋白的酶活性来达到降低细胞胆固醇水平,进而实现杀伤癌细胞发挥抗癌作用的目的。本研究首先利用组学数据筛选出胆固醇代谢过程中的关键基因DHCR24,进而以DHCR24蛋白为靶Cellular immune response点,利用分子对接从中国天然产物数据库中筛选DHCR24抑制剂,接下来进行分子动力学模拟评估其在模拟的自然状态下与DHCR24蛋白的结合情况,并利用人肝癌细胞株Hep G2细胞验证DHCR24天然产物小分子抑制剂的降胆固醇和抗癌生物活性,并初步探讨其发挥作用的分子机制。首先,本研究利用GEO数据库对数据集中的脂肪组织样本筛选出差异表达基因,并对其进行GO和KEGG分析;从Gene Cards数据库、Pharm GKB数据库中分别收集高脂血症和胆固醇代谢的相关基因,将从3个数据库中收集到的基因取交集,筛选得到出关键基因之一为DHCR24。这一结果暗示,DHCR24是高脂血症和胆固醇代谢的关键基因,具有成为降胆固醇药物开发新靶点的极大潜力。然后,我们以DHCR24蛋白为靶点,采用计算机分子对接的方法,从包含五万多种中药单体成分小分子的中国天然产物数据库中筛选可能具有抑制DHCR24酶活性的小分子抑制剂。通过与DHCR24的底物链甾醇(Desmosterol)结合能值进行比较,将对接后的小分子的结合能值进行排序,初步筛选出排序靠前的533个候选天然产物小分子。对筛选出的候选小分子进行类药性筛选,将再次筛选得到的小分子进行下一步的精确对接,根据对接结果以及药物的易获得性等因素,最终确定3种候选天然产物小分子用于后续研究,分别为19990、36066和40441。为了评估对接体系的稳定性,并研究3种候选天然产物小分子与DHCR24蛋白的相互作用模式,采用分子动力学模拟的方法来评估3种候选天然产物小分子在计算机模拟的自然状态下与DHCR24蛋白的结合情况。均方根偏差结果显示3种候选天然产物小分子在100 ns的体系下趋于稳定。根据MMPBSA算法计算配体-受体的结合自由能,结果显示3种候选天然产物小分子的结合能力均强于底物链甾醇,并对动力学模拟后的小分子与DHCR24蛋白的结合位置进行分析,结果显示3种候选天然产物小分子均结合在DHCR24受体的链甾醇区域。以上结果均表明3种候选天然产物小分子能够竞争性地抑制链甾醇与DHCR24受体的结合。最后,我们利用人肝癌细胞株Hep G2细胞,在细胞水平对筛选出的3种候选小分子的降胆固醇和抗癌效果进行验证。在降胆固醇效果方面,通过胆固醇荧光染料非律平对细胞膜胆固醇进行染色;细胞油红O染色观察脂滴积聚情况;检测试剂盒测量细胞内胆固醇和甘油三酯水平;利用高效液相仪器检测细胞内胆固醇。结果显示候选小分子36066和40441的降胆固醇效果优于DHCR24抑制剂U18666A,而19990的降胆固醇效果欠佳。在抗癌效果方面,通过培养细胞进行划痕实验,观察细胞迁移能力;集落形成实验检测其增殖活性;油红O染色观察细胞在有血清状态下给药后脂滴积聚情况;Western Blot实验检获悉更多测对AKT蛋白活性的影响。结果显示药物19990、36066和40441均会抑制Hep G2细胞的迁移和增殖,且在有血清的情况下细胞内胆固醇水平下降,并对GDC-0973分子量效果最好的36066和40441药物进行Western Blot检测,观察到可降低细胞中p-AKT的水平,推测可能是其发挥抗癌作用的主要机制之一。综上所述,本实验通过组学分析获取胆固醇代谢过程中的关键基因DHCR24,明确了DHCR24基因在胆固醇代谢调节中的重要性,然后以DHCR24蛋白为靶点进行计算机虚拟筛选,初步得到DHCR24酶的竞争性抑制剂候选天然产物小分子,随后通过细胞实验对候选天然产物小分子降胆固醇和抗癌的效果进行初步探索和确认。因天然产物小分子成分的结构差异性,我们的研究发现了DHCR24的候选天然产物小分子抑制剂,为以其为先导化合物开发一系列新药,并快速开发出具有我国自主知识产权的降血脂新药,以及以DHCR24为靶点进行抗肿瘤新方法的研究奠定了坚实基础。