髓母细胞瘤(Medulloblastoma,MB)是儿童时期中枢神经系统(CNS)最常见的恶性胚胎性肿瘤,约占所有儿童中枢神经系统肿瘤的10%。大多数MB病例起源于小脑中线或后窝蚓部。肿瘤恶性程度高,侵袭转移性强,易脑脊液播散,患者病死率高。MB是高度异质性的肿瘤,根据组织形态学不同,分为:经典型(Classic MB)、促纤维增生/结节型(Desmoplastic/nodular(D/N)MB)、伴广泛结节型(MB with extensive nodularity(MBEN))和大细胞/间变型(Large/anaplastic(LC/A)MB)四种类型。2021年新出版的中枢神经系统肿瘤WHO分类第五版明确将髓母细胞瘤分为四种分子亚型:WNT活化型、SHH激活伴TP53野生型、SHH激活伴TP53突变型和非WNT/非SHH型。非WNT/非SHH型又可以进一步分为包含8种亚型的Group 3和Group 4组。这四种分子亚型的MB具有明显不同的临床、病理形态和分子生物学特征,不同亚型患者之间预后差异显著。其中,WNT活化型极少软脑膜播散,此类患者对术后放化疗的敏感性最高,发生肿瘤转移的可能性最小,预后极好。WNT活化型儿童MB患者10年生存率可达95%。因此,对MB患者进行分子分型分层诊断具有重要的临床意义,尤其是筛选出WNT活化型病例,避免因过度治疗而导致的相关副作用的影响。MB分子分型常用的检测方法包括:NGS(Next generation sequencing)测序和DNA甲基化测序等。尽管NGS等高通量的基因检测方法比免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)方法更精确,但由于价格昂贵,所以使用受限。因此,寻找特异性、灵敏性高的免疫组化标记物,替代高通量的分子检测,快速有效的对MB患者进行辅助分型,评估患者预后,制定合适的治疗方案具有重要的诊断价值。尤其是对于减少WNT活化型MB患者的过度治疗,从而提高患者生存质量,具有重要的临床意义。在MB分子分型的病理诊断中,可用的免疫组化指标TGF-beta/Smad抑制剂包括:β-catenin(β-连环蛋白)、GAB1(GRB2 Associated Binding Protein 1)和YAP1(Yes-associated protein 1)。但由于敏感性和特异性不理想,一直没有得到广泛使用。例如,β-catenin核阳性表达是WNT活化型MB的有力指标,但在实际工作中,即使是分子检测证实的,具有CTNNB1基因突变的WNT活化型MB,也很少见到β-catenin核阳性表达。因此,是否存在其他免疫组化指标可以替代β-catenin鉴别WNT活化型成为我们探究的方向。β-catenin在细胞核内与淋巴样增强因子1(Lef-1)特异性相互作用形成转录复合体,调控WNT信号通路。考虑到β-catenin与Lef-1之间的特异性相互作用,我们推断Lef-1可能被用作WNT活化型MB的识别标记。目前,未见Lef-1免疫组化在MB中的报道。因此,在本研究中,我们检测了 Lef-1蛋白在MB中的表达,并将其与β-catenin的表达情况进行比较,以预测WNT活化型的MB。和MYC高度表达相关的非WNT/非SHH型MBHepatic differentiation恶性程度最高、预后最差,总生存率低于50%,因此被称为“极高风险”亚型。例如,伴有MYC扩增的Group 3型MB患者目前需接受强化治疗,包括手术切除和全脑脊髓照射,以及后续强化化疗。尽管采用了强化治疗,许多患者仍然死于该疾病,即使是幸存,也遭受到严重的治疗相关副作用的影响。因此,我们为了快速、高效的评估MB患者的风险分层和预后,我们进一步探究免疫组化标记物与MB患者的临床病理特征以及复发转移之间的关系。近期研究显示,Oligo2(Oligodendrocyte lineage transcription factor 2)是MYC扩增的MB高风险亚群的生物标志物和有效的治疗靶点,尤其是对于MYC扩增的MB亚组中,提示预后不良。因此,在本课题中,我们将通过免疫组化方法进一步评估Oligo2在判断不同分子分型MB复发风险中的应用价值。研究方法:收集齐鲁医院2017年-2022年的MB患者术后石蜡标本59例,实际随访成功并获得完整临床病理资料51例。由两名高年资的病理医师复核切片,确认病理诊断后进行组织学分型。(1)根据临床病理资料(年龄/性别/组织学分型/分子分型)将51例MB患者进行分组;(2)对51例MB石蜡组织,进行基于NGS的MB分子分型检测(包括62个MB相关基因和染色体的分子检测);(3)将NGS结果中的WNT活化型病例进行CTNNB1 3Exon的Sanger测序进一步验证;(4)免疫组化检测β-catenin、Lef-1、YAP1、GAB1 及Oligo2、Ki67在51 例MB病例中的表达;(5)通过采取电话随访的方式,获得病人复发转移情况;(6)分析上述蛋白表达情况与分子分型之间的关系,以及与肿瘤复发死亡的关系。结果:(1)在51例MB患者中,中位年龄10岁,男性患者为28例(54.9%),女性患者为23例(45.1%),男女比例1.2:1。经典型为29例(56.8%),促纤维增生/结节型为15例(29.4%),大细胞/间变型为7例(13.7%),广泛结节型0例;(2)经NGS测序,实际测序成功37例,其中,将7例归为WNT活化型,11例归为SHH激活伴TP53野生型,1例为SHH激活伴TP53突变型,18例归为非WNT/非SHH型;(3)经Sanger测序成功4例,CTNNB1基因3号外显子碱基突变位点分别为001904.4:c.101G>A,001904.4:c.94G>T,001904.4:c.98G>C,001904.4:c.109T>C;(4)免疫组化标记物表达与分子分型的关系①β-catenin在所有MB病例均显示肿瘤细胞膜或细胞浆表达,核阳性病例表现为局灶性散在表达(小于1%肿瘤细胞)。在弥漫的细胞膜/浆背景中,很难发现零星散在的β-catenin核阳性表达。我们选择β-catenin只要有核染色即判断为阳性,统计学分析显示β-catenin核染色阳性与WNT活化型密切相关(P<0.001)。如果参照文献以1%或者1%以上为阳性Cut-off值,则β-catenin核染色阳性率为0,无统计学相关性;②Lef-1染色阳性均表现为核阳性,Lef-1在WNT型中阳性率为100%(7/7),在SHH型中为41.6%(5/12),在非WNT/非SHH型中无表达。在21例Lef-1阳性表达的MB中,7例为弥漫阳性(阳性细胞大于50%),14例为局灶细胞阳性(阳性细胞小于50%)。Lef-1弥漫阳性的7例病例组织形态均为经典型,NGS测序结果证实为WNT活化型。Lef-1阳性表达与MB的分子分型有显著统计学相关性(P<0.001)。Lef-1核染色弥漫阳性高度提示WNT活化型MB,可作为WNT活化型的替代免疫组化标记物;③YAP1蛋白定位于细胞核。7例WNT活化型中,YAP1阳性6例(85.7%);12例SHH活化型中,YAP1阳性6例(50%),18例非WNT/非SHH型中,YAP1均阴性。YAP1表达在WNT型与非WNT/非SHH型间有统计学差异(P<0.001);在SHH型与非WNT/非SHH型间有统计学差异(P<0.005),在WNT型和SHH型间无统计学差异(P>0.05);④GAB1蛋白定位于细胞浆或细胞膜,7例WNT活化型中,GAB1阳性4例(57.1%),12例SHH激活型中,GAB1阳性10例(83.3%),18例非WNT/非SHH型中,GAB1阳性6例(阳性率33.3%)。GAB1的表达在SHH激活型与非WNT/非SHH型间有统计学差异(P<0.05),但在WNT活化型和SHH激活型,以及WNT活化型和非WNT/非SHH型均未发现统计学差异(P>0.05Apoptosis抑制剂);(5)免疫组化标记物表达与患者复发死亡的关系①Oligo2在MB中的表达以及与复发的相关性Oligo2在所有病例均未见弥漫性或者大于10%的部分表达模式。与胶质瘤中的弥漫阳性表达形成对比,可起到鉴别诊断的作用。51例MB中,有20例表现为Oligo2散在肿瘤细胞的表达(阳性细胞约1%-5%)。我们以1%为Oligo2阳性表达Cut-off值,在20例复发阳性病例中,Oligo2阳性12例,约占60%,在无复发的31例MB中,Oligo2阳性8例,约占25.8%。Oligo2表达与MB患者的复发有统计学差异(P<0.05)。同时,我们比较了不同组织学分型和分子分型中Oligo2的表达情况,均未发现统计学差异(P>0.05);②Ki67表达与MB病例复发转移的关系51例MB患者的Ki67增值指数介于20%-90%之间。复发组Ki67均值为(58.50±2.92),无复发生存组Ki67均值为(43.87±2.05)。Ki67表达在复发组与无复发组之间有显著性差异(P<0.001)。同时,我们比较了不同组织学分型和分子分型中Ki67的均值,均未发现统计学差异(P>0.05)。结论:1.Lef-1免疫组化蛋白表达可作为比β-catenin更敏感的标记物来预测WNT活化型的MB病例,弥补β-catenin染色难以识别的不足;Lef-1弥漫阳性表达高度提示是WNT活化型;2.MB病例中一般不表达Oligo2,本课题发现散在细胞Oligo2的表达(1%-5%肿瘤细胞阳性)与MB患者的复发密切相关,结合最新文献发现,提示Oligo2阳性细胞对于肿瘤干细胞特性的维持,以及在肿瘤复发中发挥重要作用;3.Ki67高表达与髓母细胞瘤复发密切相关,但在各组织学分型与分子分型之间不存在显著性差异,提示可作为一个独立的复发判断指标。