乳房炎是奶山羊养殖过程中常见疾病之一,对奶山羊养殖业造成了经济损失。对于奶山羊乳房炎应当遵循以预防为主、防治结合的理念,提高奶山羊乳房天然免疫防御功能是预防乳房炎的重要措施。山羊乳头皮肤及乳头管管腔上皮组织是山羊乳房抵御病原微生物侵袭的第一道屏障。角质形成细胞是组成上皮组织最主要的细胞类型之一,可以产生多种抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)保护乳房免受感染,其中抗菌肽S100A7具有良好的抗菌活性和参与机体天然免疫防御备受关注。C型钠肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是钠肽系统的成员,主要通过与钠肽受体-B(natriuretic peptide receptor B,NPR-B)结合,参与包括炎症反应在内的多种生理活动的调节。但是山羊乳汁中抗菌肽S100A7、CNP的含量与乳房炎的关系尚未有研究报道。此外,作为山羊乳房抵抗病原微生物侵袭第一道屏障的乳头皮肤和乳头管中抗菌肽S100A7的表达调控机制尚不清楚。本研究检测分析了奶山羊乳汁中抗菌肽S100A7、CNP含量与乳房炎之间的相关性,并进一步探究了CNP对山羊乳头角质形成细胞(Goat teat keratinocytes,GTKs)抗菌肽S100A7表达的影响和调控机制。为CNP作为山羊乳房分泌抗菌肽S100A7的调控因子,参与乳房天然免疫防御功能的假说提供理论和试验依据。研究内容和研究结果:(1)结合平板菌落计数、体细胞计数、临床诊断等结果将130份奶山羊乳汁样品分组,其中健康组40份,占总样本量的30.8%,隐性乳房炎组70份,占总样本量Emricasan小鼠的53.8%,临床型乳房炎组20份,占总样本量的15.4%;ELISA结果表明隐性乳房炎组中抗菌肽S100A7和CNP的含量著高于健康组和临床型乳房炎组;各乳房炎类型乳汁中抗medical informatics菌肽S100A7和CNP的含量变化极显著相关,相关系数r=0.7022;与检测乳汁中抗菌肽S100A7的含量和体细胞数相比,检测CNP的含量对奶山羊隐性乳房炎的预测效果更好。(2)苏木精-伊红染色结果显示患乳房炎的乳头组织与健康乳头组织相比,乳头皮肤和乳头管角质层较薄,表皮层细胞排列混乱,上皮组织中可见血细胞浸润;免疫组织化学染色结果表明抗菌肽S100A7、CNP、NPR-B均主要表达定位于山羊乳头皮肤和乳头管上皮组织中,且乳房炎乳头组织中抗菌肽S100A7和NPR-B的表达量显著高于健康乳头组织。(3)体外分离培养山羊乳头皮肤角质形成细胞(Goat teat skin keratinocytes,GTSKs)和乳头管角质形成细胞(Goat teat canal keratinocytes,GTCKs),两类细胞形态均呈典型的铺路石状,生长曲线呈“S”形;细胞免疫荧光染色和Western Blot试验发现分离得的细胞表达角质形成细胞标志物角蛋白5和角蛋白14,但不表达成纤维细胞标志物波形蛋白,说明分离的细胞是GTSKs和GTCKs;RT-PCR结果表明NPR-B m RNA在两类细胞中均呈高表达。(4)ELISA检测结果表明脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)诱导GTSKs和GTCKs分泌抗菌肽S100A7,同时也上调了细胞中炎性因子IL-6、TNF-α和IL-1β的表达;CNP诱导GTSKs和GTCKs分泌抗菌肽S100A7;CNP显著上调山羊乳头角质形成细胞内第二信使环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate,c GMP)的含量,添加PKG抑制剂KT5823后与单独使用CNP时相比,细胞中抗菌肽S100A7的分泌量显著降低,表明CNP通过激活NPR-B/c GMP/PKG信号通路实现对细胞分泌抗菌肽S100A7的调控;Western Blot检测结果显示单独用CNP处理后细胞GSI-IX使用方法中Erk1/2和c-Fos的磷酸化水平显著上调,但加入抑制剂后,CNP对p-Erk1/2和p-c-Fos的这种上调作用被显著抑制。以上结果表明CNP通过激活NPR-B/c GMP/PKG通路进一步活化Erk/c-Fos通路来调控山羊乳头角质形成细胞中S100A7的分泌。综上所述,本研究发现隐性乳房炎乳汁中抗菌肽S100A7、CNP的含量显著高于健康组和临床型乳房炎组,CNP可以作为奶山羊隐性乳房炎的诊断标志物。并进一步证明了CNP通过激活NPR-B/c GMP/PKG信号通路并进一步活化Erk/c-Fos信号通路来调控山羊乳头角质形成细胞中抗菌肽S100A7的分泌,从而参与山羊乳房天然免疫防御功能。