目的:粉葛(Pueraria montana var.thomsonii(Bentham)M.R.Almeida),是药食同源植物,具有解酒、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌等多种保健功能。植物组织培养是一种无性繁殖方式,可用于规模化生产活性次生代谢产物,具有不受地域、季节、虫害限制,生长周期短等诸多优势。但目前有关粉葛愈伤组织培养的研究还不系统不完善,且有关其活性次生代谢产物的相关研究也不深入不明确。本课题基于粉葛愈伤组织前期实验表现的良好抗菌活性,拟对其抗菌愈伤组织的培养体系、次生代谢产物的生物活性及其化学成分、活性成分制备工艺和应用进行系统探索,以期为粉葛愈伤组织次生代谢产物的开发利用提供科学依据。方法:首先利用不同消毒剂优化不同外植体的消毒条件,不同植物激素优化愈伤组织诱导条件,随后优化强抗菌能力愈伤组织类型的增殖条件并大量培养;分级制备愈伤组织的不同极性次生代谢产物,基于8株革兰氏阳性菌和阴性菌,DPOncolytic vaccinia virusPH、ABTS和总抗氧化能力等抗氧化指标以及人胃癌细胞SGC-7091和人肺癌细胞A549等细胞系评估其生物活性;并进一步基于色谱分离、活性测试和波谱等技术,追踪愈伤组织中的抗菌次生代谢产物;最后优化活性成分的制备工艺,并研究其对贮藏鲜猪肉的防腐效果。结果:1.确定了温室幼苗外植体为适宜的培养原材料,其叶片、叶柄和茎段最佳消毒条件分别为75%酒精30 s+0.1%升汞10min+2%次氯酸钠10 min、75%酒精30 s+0.1%升汞5 min+2%次氯酸钠15 min、75%酒精3https://www.selleck.cn/products/azd9291.html0 s+0.1%升汞10 min+2%次氯酸钠5 min,愈伤组织诱导的最佳条件为2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.5 mg·L~(-1) NAA、2.0 mg·L~(-1) 6-BA+0.1 mg·L~(-1) NAA、2.0 mg·L~-~1 6-BA+0.1 mg·L~(-1) NAA,其中茎段诱导率最高能达到96.3%。2.确定了茎段愈伤组织为抗菌活性较强的类型,并优化了其增殖条件为1.10 mg·L~(-1) 6-BA+0.25mg·L~(-1) NAA+0.95 mg·L~(-1) 2,4-D、MS基础培养基、2%蔗糖、0.8%琼脂、p H值5.8、温度25℃、光照18 h/黑暗6 h、接种5～8块/瓶、转接时间15 d,该条件下愈伤组织主要为黄绿色或黄色,组织较为松散,增殖系数能达到9～10。3.四种不同极性提取物中乙酸乙酯提取物的活性整体较强,对粪肠球菌、苏云金芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等多个革兰氏阳性菌抑制作用较好,其最小抑菌浓度(MIC)为0.195～1.536 mg·m L~(-1),对DPPH和ABTS的半抑制浓度(IC_(50))分别为0.2795和0.0640 mg·m L~(-1),质量浓度在1.5 mg·m L~(-1)时相当于1.3420μmol·m L~(-1) Fe SO_4的还原能力,对人肺癌细胞A549也具有较好的抑制作用,其EC_(50)为260.90μg·m L~(-1),但4种不同极性提取物对人胃癌细胞SGC-7091无明显抑制作用。4.总黄酮与总酚含量在乙酸乙酯提取物中富集度较高、总多糖含量在水提取物中富集度较高,相关性分析表明总黄酮可能是重要的抗菌成分;通过活性追踪,从乙酸乙酯提取物的抗菌组分Fr.2.4中分离鉴定出大豆苷元(1)和染料木素(2),从粗组分Fr.3中分离鉴定出大豆苷(3)和染料木苷(4),均为异黄酮成分,抗菌结果显示,染料木素是抑制粪肠球菌和苏云金芽孢杆菌的主要成分,其MIC值分别为19.53μg·m L~(-1)和4.88μg·m L~(-1),而大豆苷、染料木苷和大豆苷元对该2株菌没有明显抑制作用;通过GC-MS分析从乙酸乙酯提取物的挥发性成分中另鉴定了5-羟甲基糠醛、β-谷甾醇、羽扇豆醇等3个潜在的抗菌成分,这些挥发性成分可能参与了部分组分对供试菌的抑制作用。5.茎段愈伤组织总黄酮的酶-超声波法最佳制备工艺为纤维素酶添加量1%、酶解温度57℃、酶解时间100 min、乙醇体积分数66%、料液比1:50 g·m L~(-1)、超声功率200 W、超声时间50 minPLX-4720分子量,提取3次,该条件下总黄酮总得率为3.055%。该法所制备的总黄酮在6～9 d内能有效延缓鲜猪肉p H和TVB-N值的上升,能一定程度上抑制猪肉表面微生物的生长和维持猪肉表面的亮度。结论:系统建立了具抗菌能力的粉葛茎段愈伤组织的消毒、诱导和增殖体系,明确了该愈伤组织的次生代谢产物具有较强的抗菌、抗氧化和微弱的细胞毒活性,且染料木素是其发挥抗菌活性的主要成分,并发现其总黄酮对鲜猪肉具有一定的防腐效果,该结果为粉葛愈伤组织次生代谢产物在食品和制药领域的开发利用提供了一定的参考。