D-丙氨酸是革兰氏阳性菌生长必需的氨基酸,参与肽聚糖合成。革兰氏阳性菌一般通过丙氨酸消旋酶转化L-丙氨酸获得D-丙氨酸。近年来有研究发现一些革兰氏阳性菌利用转运蛋白吸收胞外的D-丙氨酸,枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Ala P和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的Ser P2已被鉴定有吸收D-丙氨酸的功能。目前,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)没有转运蛋白被鉴定有吸收D-丙氨酸的功能。现有研究对地衣芽孢杆菌的丙氨酸代谢认识不充分。本研究在地衣芽孢杆菌9945a基因组中通过同源比对找到一个可能参与D-丙氨酸吸收的转运蛋白Ydg F1,对其进行结构分析与功能鉴定;根据Ydg F1的功能改造全细胞催化剂,分析转运改造对地衣芽孢杆菌全细胞催化合成α-甲基-L-丝氨酸的影响。主要研究结果如下:(1)分别构建ydg F1敲除菌株9945aΔydg F1和ydg F1过表达菌株9945a/p HY300-Shu-ydg F1。用仅含有葡萄糖、无机盐、D-丙氨酸的PDA培养基比较菌株间的生长差异,发现ydg F1的敲除削弱了地衣芽孢杆菌9945a在PDA培养基中的增殖能力,ydg Double PathologyF1的过表达增强了地衣芽孢杆菌9945a在PDA培养基中的增殖能力。细胞吸收实验中9945aΔydg F1吸收D-丙氨酸的浓度明显低于9945a,而9945a/p HY300-Shu-ydg F1吸收的浓度略高于9945a,进一步验证了Ydg F1在地衣芽孢杆菌9945a中参与D-丙氨酸吸收;ydg F1的敲除或过表达对地衣芽孢杆菌9945a吸收L-丙氨酸的能力几乎没有影响,说明转运蛋白Ydg F1对D-丙氨酸有手性偏好。此外,Ydg F1还可能吸收L-天冬酰胺及与L-天冬酰胺结构相近的氨基酸。(2)采用实时荧光定量PCR评价9945a、9945aΔydg F1在LB培养基中不同生长时期ydg Fselleck产品1基因的相对表达量,发现9945a的ydg F1相对表达量在转换期和稳定期逐渐提高;参与肽聚糖循环的β-乙酰氨基葡萄糖苷酶Ybb D、肽聚糖酰胺酶Ybb E也有类似的结果。对9945a、9945aΔydg F1后期的培养基进行平板活菌计数,计算CFU。9945aΔydg F1后期培养基的CFU低于9945a,其后期衰亡速率快于9945a,说明ydg F1的敲除减弱了地衣芽孢杆菌9945a后期的生存能力。(3)在地衣芽孢杆菌9945a中异源表达嗜碱副球菌(Paracoccus alcaliphilus)的α-甲基丝氨酸羟甲基转移酶(α-m确认细节ethylserine hydroxymethyltransferase,MSHMT),全细胞催化D-丙氨酸生成α-甲基-L-丝氨酸。同时过表达转运蛋白Ydg F1和MSHMT的9945a/p HY300-Shu-ydg F1-Shu-mshmt全细胞催化1 h合成的α-甲基-L-丝氨酸与仅过表达MSHMT的9945a/p HY300-Shu-mshmt相比增加了13.6%。D-丙氨酸初始浓度为30 mmol·L~(-1)时,9945a/p HY300-Shu-ydg F1-Shu-mshmt全细胞催化3 h合成20.39 mmol·L~(-1)的α-甲基-L-丝氨酸,转化率为85.1%。本研究初步鉴定了地衣芽孢杆菌9945a转运蛋白Ydg F1的转运功能,并探究了Ydg F1在地衣芽孢杆菌9945a后期生存中的作用;利用转运蛋白的功能改造全细胞催化剂的细胞膜,提高其传质效率,为之后全细胞催化的优化提供了参考。