目的:通过行为学、形态学、分子生物学、蛋白组学等研究方法,从抑制损伤部位及背根神经节、脊髓背角炎症因子表达、卫星胶质细胞及星形胶质细胞活化的角度,揭示坐骨神经损伤导致的外周及中枢痛觉敏化的发生机制,以及齐刺“环跳”穴降低其外周及中枢痛觉敏化程度的作用机制,为临床针刺治疗疼痛提供新的理论支持。材料与方法:1.动物分组与造模SPF级SD大鼠70只,分为假手术组(Sham Operation Group,SHAM)、模型组(Sciatic Nerve Crush Injury Group,SNCI)、齐刺组(Triple Acupuncture Group,TA)、单刺组(Single Acupuncture Group,SA)和药物组(Yao Wu Group,YW),每组14只。除SHAM组外,其余组大鼠进行坐骨神经挤压伤模型制备。造模后,每组随机抽取2只大鼠,麻醉并暴露坐骨神经主干后,进行神经传导速度检测。除SHAM组外,其余各组神经传导速度均在10m/s以下,即认为该组造模成功。造模第二天治疗前,进行热缩足反射潜伏期检测并记录。2.干预方法造模后隔日开始进行针刺及药物灌胃干预。TA组和SA组以损伤侧的“环跳”穴为针刺部位,SA组针刺入约深度为10～12mm,以触及深层selleck化学肌肉组织且针下有涩滞、紧张感为宜;TA组先在穴位正中刺一针,深度为10～12mm,然后在该针上下5mm各刺一针,针尖方向指向第一针针尖。两组每日治疗1次,每次20min,连续干预14天。YW组采用布洛芬悬浊液0.5mg/kg体重标准灌胃,每日1次,连续干预14天。3.取材和指标检测取材当天,先进行坐骨神经运动功能评价及热缩足反射潜伏期检测,然后麻醉大鼠,暴露腹主动脉并取血。过量麻醉处死大鼠后,取坐骨神经。采用HE染色法观察坐骨神经组织病理变化;采用ELISA法检测血清及坐骨神经组织IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2蛋白表达量。各组随机选取6只大鼠,取大鼠腰段背根神经节组织。ELISA法检测背根神经节组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达量。比色法检测背根神经节组织中ATP含量。RT-PCR法检测背根神经节组织中Cx43、GFAP、P2X7基因表达水平。选取各组其余的6只大鼠,取大鼠腰段脊髓组织。ELISA法检测脊髓组织中IL-1β、IL-6、TNF-α含量;比色法检测脊髓组织中ATP含量。RT-PCR法检测脊髓组织Cx43、GFAP、P2X7表达量;免疫组化及免疫荧光法检测脊髓组织中Cx43、GFAP、P2X7表达水平。结果:一部分齐刺“环跳”穴对坐骨神经损伤大鼠形态修复、疼痛程度及炎症因子水平影响的实验研究1.大鼠状态:实验期间各组大鼠无死亡。SHAM组大鼠各项活动均正常。SNCI组大鼠有跛行,易惊吓,情绪易激动。TA组、SA组和YW组大鼠表现较SNCI组大鼠有不同程度改善。2.坐骨神经运动功能评价钳夹法损伤坐骨神经后,大鼠坐骨神经运动功能指数明显下降(P<0.01)。治疗后,与SNCI组比较,TA组、SA组及YW组均出现上升(P<0.01),TA组、SA组显著上升(P<0.01),TA组上升程度高于SA组(P<0.01)。3.热缩足反射潜伏期评价结果显示:结果显示,与SHAM组比较,治疗前,钳夹法损伤坐骨神经大鼠热缩足反射潜伏期显著下降(P<0.01),造模各组大鼠之间无显著差异(P>0.05),具有组间可比性。表明钳夹法严重损伤了大鼠坐骨神经组chemiluminescence enzyme immunoassay织,形成了痛觉过敏。经干预措施后,与SNCI组比较,TA组显著上升(P<0.01),效果优于SA组及YW组,提示在降低因神经损伤导致的痛觉敏化方面,齐刺法效果明显。4.实验大鼠坐骨神经组织HE染色结果显示SHAM组大鼠坐骨神经组织细胞排列整齐,规整,方向一致、无巨噬细胞浸润。SNCI组大鼠坐骨神经组织可见部分大颗粒巨噬细胞浸润,细胞排列明显紊乱。TA组、SA组和YW组可见少量巨噬细胞浸润,细胞排列不规整,TA组优于SA组和YW组。5.ELISA法检测各组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2含量显示:与SHAM组比较,SNCI组IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及YW组IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平显著降低(P<0.01),TA组IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2水平低于SA组及YW组(P<0.01)。6.ELISA法检测各组大鼠坐骨神经组织IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2含量结果显示:与SHAM组比较,SNCI组IL-1β、IL-6、TNFTrichostatin A-α、PGE2蛋白表达显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及YW组IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2表达显著降低(P<0.01),TA组IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2表达低于SA组及YW组(P<0.01)。第二部分基于卫星胶质细胞活化探讨齐刺环跳穴干预坐骨神经损伤大鼠外周敏化的作用机制。1.ELISA法检测各组大鼠背根神经节中IL-1β、IL-6、TNF-α含量结果显示:与SHAM组比较,SNCI组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及YW组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01),TA组IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于SA组及及YW组(P<0.01)。2.比色法检测大鼠背根神经节组织ATP含量:与SHAM比较,SNCI、TA组、SA组及YW组大鼠背根神经节组织ATP含量显著增加(P<0.01);与SNCI比较,TA组、SA组及YW组大鼠背根神经节组织ATP含量明显减少(P<0.01);TA组大鼠背根神经节组织ATP含量低于SA组及YW组(P<0.01)。3.RT-PCR法检测各组大鼠背根神经节中Cx43、GFAP、P2X7表达结果显示:与SHAM组比较,SNCI组Cx43、GFAP、P2X7水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及及YW组Cx43、GFAP、P2X7水平显著降低(P<0.01),TA组Cx43、GFAP、P2X7水平低于SA组及及YW组(P<0.01)。第三部分基于星形胶质细胞活化探讨齐刺环跳穴干预坐骨神经损伤大鼠中枢敏化的作用机制。1.ELISA法检测各组大鼠脊髓背角组织IL-1β、IL-6、TNF-α含量结果显示:与SHAM组比较,SNCI组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及及YW组IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著降低(P<0.01),TA组IL-1β、IL-6、TNF-α水平低于SA组及及YW组(P<0.01)。2.比色法检测大鼠脊髓背角ATP含量:与SHAM比较,SNCI、TA组、SA组及YW组大鼠脊髓背角ATP含量显著增加(P<0.01);与SNCI比较,TA组、SA组及YW组大鼠脊髓背角ATP含量明显减少(P<0.01);TA组大鼠脊髓背角ATP含量低于SA组及YW组(P<0.01)。3.RT-PCR法检测各组大鼠脊髓背角组织Cx43、GFAP、P2X7表达结果显示:与SHAM组比较,SNCI组Cx43、GFAP、P2X7水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及及YW组Cx43、GFAP、P2X7水平显著降低(P<0.01),TA组Cx43、GFAP、P2X7水平低于SA组及及YW组(P<0.01)。4.免疫组化法检测各组大鼠脊髓背角组织Cx43、GFAP、P2X7蛋白表达水平结果显示:与SHAM组比较,SNCI组Cx43、GFAP、P2X7水平显著升高(P<0.01)。与SNCI组比较,TA组、SA组及及YW组Cx43、GFAP、P2X7水平显著降低(P<0.01),TA组Cx43、GFAP、P2X7水平低于SA组及及YW组(P<0.01)。5.免疫荧光法检测各组大鼠脊髓背角组织Cx43、GFAP、P2X7蛋白表达标记大鼠脊髓背角组织中Cx43、GFAP、P2X7蛋白荧光强度在SNCI组较高,SHAM组表达较低。相比SNCI组,TA组、SA组和YW组荧光有不同程度减弱或减少。TA组优于SA组及YW组。结论:1.齐刺环跳穴可以改善坐骨神经损伤大鼠一般状态,升高坐骨神经损伤大鼠足底热缩阈值,改善坐骨神经损伤大鼠坐骨神经组织病理形态,抑制坐骨神经损伤大鼠血清及坐骨神经组织中IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2等炎症因子的表达,减轻炎症反应,改善疼痛症状。齐刺环跳穴治疗坐骨神经损伤大鼠坐骨神经痛有效。2.齐刺环跳穴可能通过抑制大鼠背根神经节神经元释放ATP、降低卫星胶质细胞P2X7受体及Cx43半通道表达程度,抑制卫星胶质细胞活化及促炎因子表达,降低坐骨神经痛外周敏化程度。3.齐刺环跳穴可能通过抑制大鼠脊髓突触部位释放ATP,降低了P2X7介导的小胶质细胞释放炎症因子,从而降低了星形胶质细胞Cx43半通道过度表达,抑制了星形胶质细胞活化及炎性因子表达,降低了中枢痛觉敏化的程度。