噬菌体抗体库技术是以噬菌体展示为基础的一种新型抗体制备技术,因其可以不经过人工免疫和杂交瘤技术也能获得较高Q-VD-Oph生产商亲和力的抗体,而被广泛应用于食品检测、医学检验等领域。食品安全问题一直备受国家和民众关注,其中青霉素类抗生素阿莫西林(Amoxicillin,AMO)在各种兽医药物制剂中大量使用,导致药物残留在动物源性食品中,对人类健康构成了重大的medical nephrectomy威胁。本研究旨在利用噬菌体抗体库技术构建库容量大、多样性丰富的单链抗体(Single-chain variable fragment,sc Fv)库,并筛选出针对AMO的单链抗体,为建立动物源性食品中AMO的免疫学快速检测方法提供理论依据。本研究从健康BABL/C雌性小鼠脾脏组织中提取总RNA,反转录合成c DNA,扩增出抗体可变区基因(VH、VL),通过重叠延伸PCR拼接成sc Fv基因。构建重组载体p CANTAB-5E-sc Fv,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,得到初级抗体基因文库,库容为6.5×10~8cfu/m L。经测序鉴定和序列分析,制备的文库多样性良好。辅助噬菌体M13KO7救援后,获得噬菌体抗体库,滴度为5×10~(12)pfu/m L。应用碳二亚胺法将卵清蛋白(Ovalbumin,OVAPCI-32765 NMR)偶联到AMO上,经紫外扫描鉴定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳确定偶联成功,考马斯亮蓝法测定AMO-OVA浓度为0.6342 mg/m L。进而以AMO-OVA为包被原,对噬菌体抗体库进行四轮“吸附-洗脱-扩增”生物淘选,最终获得一株较高亲和力噬菌体抗体,命名为AMO-sc Fv。经测序后获得AMO-sc Fv核苷酸序列,长度为735 bp,共编码245个氨基酸,VH与鼠源重链可变区序列同源性达91.2%(Sequence ID:BAE71421.1),VL与鼠源kappa轻链序列同源性达92%(Sequence ID:AFR53773.1)。AMO-sc Fv基因通过载体p ET-28a在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达片段大小约为28 k Da。经竞争性间接ELISA鉴定表达后的AMO-sc Fv对AMO有良好的结合活性,其半数抑制浓度(IC_(50))为105.9 ng/m L,与氨苄西林有较高的交叉反应率,与羧苄西林、苯唑西林、氯唑西林、青霉素V及头孢唑啉的交叉反应率较低。以上结果表明已成功构建天然鼠源噬菌体抗体库,且最终筛选出一株抗AMO单链抗体,具有一定的灵敏度与特异性,为后期建立免疫学快速检测动物源性食品中AMO的方法提供理论依据。