马铃薯疮痂病是一种由链霉菌引起的土传性病害,病原菌通过定殖或寄生在土壤中进行传播,难以控制,严重降低了马铃薯的经济价值。先前主要通过使用化学药剂、调整土壤pH值等方法进行疮痂病的防治,但化学药剂的过度使用会造成土壤和环境污染。近来,生物防治因其低毒性、高特异性和高效率已成为抵御农业病虫害极具前景的方式。据报道,一些微生物具有防治马铃薯疮痂病的效果,但应用效果与化学方法还存在一定差距,且作用机制尚不清晰,限制了其进一步应用。为此,本研究对抑制病原菌Streptomyces scabies的生防菌株进行了筛选、鉴定和生防效果评价,同时初步解析了其拮抗疮痂链霉菌的机制,并通过发酵优化提高了主要抑菌物质的产量。主要研究结果如下:(1)生防菌的筛选、鉴定及其生物防治效果评价。首先在马铃薯疮痂病发生地块通过抑菌圈法筛选到一株拮抗S.scabies的Bacillus subtilis YPS-7。然后以B.subtilis YPS-7为亲本菌株,采用ARTP诱变选育的方式获得一株对S.scabies拮抗活性更高的B.subtilis YPS-32。田间防治结果D-Lin-MC3-DMA IC50表明B.subtilis YPS-32对马铃薯疮痂病具有高的拮抗能力。在播种前和开花期间施用两次B.subtilis YPS-32,马铃薯疮痂病的防治率达到83.70%,马铃薯单果增产达到38.32%。(2)B.subtilis YPS-32的全基因组解析。全基因组测序结果表明,YPS-32含有一条4,084795 bp的环状染色体,编码4262个基因,GC含量为43.88%;它包含86个t RNA、30个rRNA和19个串联重复;没有发现质粒。进一步对其基因组中参与生物防治和促进植物生长相关的基因(基因簇)进行分析,结果表明B.subtiliPacemaker pocket infections YPS-32具有表面活性素、丰原素、儿茶酚铁载体、溶杆菌素、聚酮和芽孢杆菌素等次级代谢产物的编码基因簇和参与氮同化、挥发性化合物合成等促进植物生长相关的基因。(3)B.subtilis YPS-32受到S.scabies侵染的转录组学和蛋白质组学应答。首先确定了B.subtilis YPS-32与S.scabies共培养24 h,B.subtilis YPS-32对S.scabies的抑制作用最强。然后通过转录组学和蛋白质组学技术分析互作过程中B.subtilis YPS-32的差异表达基因和蛋白,结果表明丰原素生物合成关键酶(WP＿160214990.1、WP＿080015512.1、WP＿160214989.1、WP＿032723105.和WP＿089172562.1)、溶杆菌素生物合成的酶(WP＿003244300.1、WP＿003227505.1)、一种与表面活性素合成相关的酶WP＿160215002.1以及儿茶酚铁载体生物合成相关的一种蛋白WP＿003245811.1,在B.subtilis YPS-32受到S.scabies侵染后,蛋白质的丰度显著上调。另外,聚酮生物合成相关基因(sps L、rfbD、rfbB和spsI)的丰度在受到S.scabies侵染后也显著上调。推测B.subtilis YPS-32可能通过上调表达上述候选抑菌物质合成基因,促进丰原素、聚酮、溶杆菌素、儿茶酚铁载体、表面活性素等代谢产物的合成从而抑制病原菌的生长。(4)Bacillus subtilis YPS-32中无痕敲除方法的建立及其应用研究。首先建立了一套B.subtilis YPS-32的无痕敲除系统。然后利用无痕基因敲除方法对B.subtilis YPS-32基因组中负责表面活性素、丰原素、聚酮、儿茶酚铁载体、溶杆菌素合成的基因簇srfABCD、ppsEDCBA、pksBCDEFGHIJLMNRS、dhbABCEF、bacABCDEFG进行了敲除,并对其拮抗S.scabies的效果进行验证。结果表明聚酮和溶杆菌素合成基因簇缺失突变株对S.scabies的抑制效果无明显变化,即溶杆菌素和聚酮不是抑制S.scabies的关键物质。儿茶酚铁载体、丰原素和表面MDV3100化学结构活性素均起到抑制S.scabies的作用,其合成基因簇缺失突变株的相对抑制率分别降低至64.00%、76.56%和72.75%。(5)快速检测表面活性素含量方法的确定和B.subtilis YPS-32生产表面活性素的发酵工艺优化。首先,确定了CPC-BTB显色法能够快速检测表面活性素的含量;然后,利用单因素试验和响应面试验得到B.subtilis YPS-32生产表面活性素的摇瓶发酵参数。优化后表面活性素的摇瓶发酵的产量为1.82 g·L~(-1),是优化前的2.27倍;进一步,在5 L发酵罐水平发酵42.8 h后,表面活性素最大产量为2.39 g·L~(-1),较优化前提高了2.96倍;最后,在100 L发酵罐水平进行小试生产条件优化。发酵36 h后,表面活性素最大产量为3.25 g·L~(-1),较优化前提高了18.2%。且研究表明发酵条件优化后的发酵液拮抗S.scabies的效果更佳。