本研究中使用的长根静灰球(Bovistella radicata(Mont.)Pat)是马勃的一种,幼嫩时可食用,成熟后可入药,民间常用其治疗足癣,因此是一种典型的食药用真菌。PD0325901供应商足癣主要是由足部致病真菌感染引起的浅表性皮肤病,严重影响人们的日常生活。近年来,治疗足癣的药物层出不穷且主要为化学治疗药物,但长期大量使用会出现耐药性,真菌耐药性已成为威胁人体健康和安全的临床现象。从天然植物或微生物中获得的抗真菌次级代谢产物更环保、副作用小、不易产生耐药性且资源丰富,因此抗真菌天然活性药物组分的获取、分析与制备,成为新药研发的主要趋势。以B.radicata孢子粉为原材料,研究其发酵液抗足癣的药效物质基础及抑菌机理。主要的研究内容及结论如下。1、源于江西的B.radicata与市售的马勃孢子粉抗菌活性对比分析,确定B.radicata孢子粉具有抗主要足癣真菌活性。研究发现了B.radicata孢子粉经过发酵后发酵液表现出了更为显著的抗真菌活性。对B.radicata孢子粉发酵条件进行了优化和抑菌效果评价。确定最佳氮源及碳源分别为蛋白胨(2g/L)和蔗糖(4g/L),最佳离子源为Mg SO_4(0.4g/L),采用单因素实验及响应面法对B.radicata孢子粉发酵条件进行优化,确定最佳发酵条件为起始p H 5.90,发酵温度23.biomimetic robotics20℃,摇床转速124.60 rpm及发酵时间为69.60 h,B.radicata孢子粉发酵液对红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)的抑菌圈直径为3.07 cm。2、通过对发酵液的成分分析,确定了发酵液中的抗真菌活性组分为SPAF(spore powder active fraction),其中包含醇溶性活性组分SPAF-1,以及水溶性活性组分SPAF-2。对醇溶性活性组分SPAF-1进行物质鉴定,确定其中主要抗真菌物质为癸醇和癸醛,SPAF-1对红色毛癣菌(T.rubrum)的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration MIC)、最低杀菌浓度(minimum fungicide concentration MFC)分别为62.4 mg/L和125 mg/L,阳性对照分别为15.6 mg/L和93.6 mg/L,而SPAF-1和阳性对照的抑菌效果(MFC/MIC)比值分别为2和6,SPAF-1的抗菌效果表现更佳。3、通过离子交换纤维素DEAE cellulose及葡聚糖凝胶sephadex LH-20相继对SPAF进行分离纯化,获得水溶性活性组分SPAF-2,采用HR-ESI-MS、FT-IR、OD_(260nm)及NMR四种检测方法对水溶性活性组分SPAF-2做鉴定分析,确定为灰球菌素(Griseococcin(s)),其中有效抗菌活性组分Griseococcin(1)的结构式和分子式分别为和C_(37)H_(4IACS-010759作用3)NO_(10),对T.rubrum的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)分别为31.2 mg/L,31.2 mg/L,特比萘酚(阳性对照)分别为15.6 mg/L,93.6 mg/L,而SPAF-2与阳性对照的抑菌效果(MFC/MIC)比值分别为1和6,SPAF-2的抑菌效果同样优于阳性对照。4、分别从T.rubrum的细胞壁、细胞膜及其组分与微观形态三个方面研究SPAF的抑菌机理。激光共聚焦荧光显微镜及电导率和胞外核酸检测结果表明,处理后的T.rubrum细胞壁及细胞膜组分发生改变且细胞质膜明显受损,核酸荧光染料与死亡的致病菌DNA结合、细胞内电解质泄漏使得胞外电导率升高、核酸物质泄漏致胞外OD_(260)nm值升高、麦角甾醇合成受阻含量下降,细胞膜通透性升高;FT-IR分析T.rubrum细胞壁与细胞膜组分表明,处理前后的T.rubrum细胞壁与细胞膜中磷脂和蛋白质组分发生改变。研究表明,SPAF对致病菌T.rubrum抑制作用的有效作用部位是其细胞壁、细胞膜及细胞核膜系统。此外,对人包皮成纤维细胞(human foreskin fibroblast HFF)的安全性评价试验结果表明,在SPAF有效抑菌浓度范围内,对人体细胞安全可靠。综上所述,本论文利用B.radicata孢子粉发酵液中的抗足癣真菌活性物质SPAF,经分离纯化后获得醇溶性的活性成分癸醇、癸醛及水溶性的活性成分灰球菌素(Griseococcin(1))。体外抗菌实验表明,两者抗足癣的主要致病T.rubrum的效果显著;抑菌机理研究表明,SPAF引起致病真菌细胞通透性的改变、细胞壁与细胞膜完整性及其组分的改变等;SPAF的安全性评价试验显示在抑菌浓度下,SPAF对HFF细胞无毒害。因此,本研究成果对足癣治疗新药开发及提升药物抗耐药性品质提供重要理论和技术支持,具有重要的开发前景和应用价值。