大环内酯类抗生素是一类广谱抗生素,作为有效的蛋白质合成抑制剂在传染性疾病、呼吸道疾病、消化道疾病等治疗中具有显著的治疗应用。PikC是人类发现的第一个天然酮内酯苦霉素的生物合成途径中的唯一一个P450酶,通过酶工程和底物工程已经极大地扩展了 PikC的底物宽泛性和产物多样性,但据我们所知,迄今为止没有任何PikC突变体能够直接氧化YC-17和narbomycin的前体化合物10-deoxymethonolide和narbonolide。为了实现对这两种没有任何锚定基团的大环内酯骨架的氧化修饰并拓展获得结构多样性大环内酯类化合物的方法,我们进行了如下实验:1.非天然底物活性酶PikCH238pAcF的构建与活性分析首先,我们通过结合PikC已有的晶体结构信息以及非天然底物分子的结构特征,利用基于非天然氨基酸的遗传密码子扩展技术对PikC进行了半理性改造。结果显示作为唯一一个同时对两种非天然底物均具有催化活性的突变体(PikCH238pAcF)分别对10-deoxymethonolide和narbonolide具有17.9%和24.7%的底物转化率。另外,与野生型相比该突变体对天然底物YC-17和narbomycin的底物转化率分别提高了 0.9和0.7倍,并且还改变了对YC-17羟基化反应的区域选择性。更重要的是,由于引入H238pAcF突变所展现的非天然活性无法在同一位点被任何蛋白质源性氨基酸所再现。这种突变体不仅实现了对没有任何锚定基团的大环内酯骨架的氧化修饰,也是对结构更加苛刻的底物中惰性C-H键激活的一次挑战。2.PikCH238pAcF的晶体学和机理分析为了深入理解突变体的非天然活性和区域选择性等催化特性的结构基础,我们分别对PikCH238pAcF的多种晶体结构和分子对接实验结果进行了分析。分析结果表明,由于pAcF的引入,PikC通过pAcF介导的氢键和保守的疏水相互作用来稳定底物的催化构象。另外,由于pAcF的引入打破了 YC-17的两个羟化位点与活性中心距离的平衡,从而改变了对YC-17催化的区域选择性。3.专一性苷元羟化酶的工程化改造在PikC多种晶体结构以及前期单点突变结果的指导下,我们通过对PikC进行多位点组合突变获得了对1 0-deoxymethynolide和narbonolide的专一性羟化酶PikCH238pAcF/E85Q/E94Q。另外,在此过程中我们意外获得了对10-deoxymLiraglutide体内实验剂量ethynolide和narbonolide羟基化活性分别提升了 0.4和0.5倍的突变体 PikCH238pAcF/E85Q。4.非天然大环内酯类化合物的人工酶级联反应的建立通过对P450酶促反应条件进行优化,突变体PikCH238pAcF/E85Q对两种非天然底物的底物转化率分别提升到75.%(10-deoxymethynolide)和78.0%(narbonolide)。另外,将突变体与UDP依赖的糖基转移酶BSGT-1相结合,在体外建立了非天然大环内酯类化合物人工酶级联反应,并通过级联反应获得了天然途径无法获得的糖基化产物。非天然大环内酯类化合物人工酶级联反应的建立为丰富大环内酯类化合物的结构多样性和筛选具有潜在治疗活性的抗生素提供了更多的选择。综上所述,本研究对一种微生物天然产物生物合成P450酶进行了非天然氨基酸介导的半理性突变。基于PikC的多种结构信息和两种非天然底物的结构特征,我们通过构建一种非天然氨基酸介导的底物结合策略,实现了对没有任何锚定基团的大环内酯骨架的氧化催化。另外,通过利用这种非天然底物活性酶(PikCH23selleckchem PLX40328pAcF)在体外构建非天然大环内酯British ex-Armed Forces类化合物人工酶级联反应获得了一系列天然途径无法获得的大环内酯类化合物,并逆转了苦霉素生物合成途径中糖基化-氧化的顺序。基于非天然氨基酸定点突变的P450酶工程策略以及从酶-底物复合物的详细结构分析中获得的机制性认识可以应用于未来更多的糖基化-氧化偶联系统的构建。此外,还可以通过外源饲喂或原位生物合成非天然氨基酸在体内实现此类生物合成途径的改造。在结构多样的非天然氨基酸的帮助下,预期可对更多的酶反应或级联反应进行功能拓展,以设计和生产更多的天然产物衍生物用于新药研发。