炎症是机体抵御损伤因素的主要防御反应,巨噬细胞在炎症调控过程中发挥重要作用,影响炎症相关疾病的转归。奶牛乳腺炎(Bovine mastitis)是由于病原微生物入侵而导致的乳腺组织炎症。巨噬细胞是乳腺先天免疫的重要组成部分,在炎症调控中发挥重要作用。巨噬细胞具有异质性,局部炎症反应特异性微环境使其活化成M1型巨噬细胞和/或M2型巨噬细胞,且M1、M2型巨噬细胞可相互转化。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类成体干细胞,可以从各种组织中分离得到,研究表明MSCs具有强大的免疫调节能力,其功能主要通过外泌体所介导。为明确MSCs外泌体在调节巨噬细胞极性转化中的作用及机制,本试验构建奶牛乳腺炎症细胞(MAC-T)模型,通过超高速离心法获得MSC-Exos。RT-PCR、ELISA、高通量测序等方法研究发现MSC-Exos可以抑制糖酵解过程促进巨噬细胞由M1型向M2型转化缓解奶牛乳腺炎症反应。具体结果如下:M2型巨噬细胞抑制奶牛乳腺炎症反应:LPS处理MAC-T,建立奶牛乳腺炎症细胞模型。IL-4处理RAW264.7,M2型巨噬细胞与炎性MAC-T共培养,RT-PCR检测发现炎性因子IL-6,IL-8和TNFPidnarulex浓度-α的m RNA水平都较LPS处理组显著降低;凋亡因子Bax和caspase-3的m RNA水平较LPS组显著降低,Bcl-2较LPS组显著升高,用流式细胞术检测细胞的凋亡率,得出的结果和RT-PCR一样。结果表明M2型巨噬细胞具有抗炎抗凋亡作用。MSC-Exos通过抑制糖酵解促进巨噬细胞由M1向M2极化:MSC-Exos处理M1型巨噬细胞,RT-PCR检测发现促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的m RNA水平显著降低,抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β和Arg-1)的m RNA水平显著升高,结果表明MSC-Exos促进巨噬细胞由M1型向M2转化;RT-PCR、ELISA检测糖酵解相关因子HIF-1α、PDK1、PKM2和LDHA的m RNA及蛋白的表达水平都较对照组显著下降。结果显示糖酵解过程受到抑制,提示MSC-Exos抑制糖酵解过程来诱导巨噬细胞由M1型向M2型极化。MSC-Exos测序以及生信分析:分离MSC-Exos,提取总RNA,高通量测序检测外泌体miRNA表达谱,共检测出556种miRNA,表达量前40的miRNA占总miRNA的93%,对表达量前40的miRNA的靶基因进行GO和KEGG分析,发现在关于细胞代谢和免疫途径中富集丰富。通过targetscan和阅读文献发现位列前40的miR-93-5p的潜在靶基因为HIF-1α。miR-93-5p通过抑制糖酵解过程来调节巨噬细胞极化:将miR-93-5p mimics转染到M1型巨噬细胞中,RT-PCR检测发现促炎细胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的m RNA水平显著降低,抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β和Arg-1)的m RNA水平显著升高,结果表明,miR-93-5p促进巨噬细胞由M1型向M2型极化。RT-PCR、ELISA检测HIF-1α、genetic variabilityPDK1、PKM2和LDHA的m RNA及蛋白水平都较对照组显著下降。上述结果提示我们,MSC-Exos通过其内容物miR-93-5p靶向HIF-1α,通过调控巨噬细胞的糖代谢促进其极性转变。本研究证明了MSC-Exos可促进巨噬细胞向M2型极化,有助于炎症的消退,并初步探索了其作用机制,为ABT-199通过调控巨噬细胞的极化状态来调控奶牛乳腺炎症反应及MSC-Exos的应用提供了理论依据。