目的:明确银椴苷(Tiliroside)对NLRP3炎症小体活化以及内毒素诱导的小鼠急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)的影响并探讨其可能的分子机制。方法:1.动物实验:实验小鼠随机分为4组:Vehicle组、LPS组、LPS+银椴苷低剂量(50 mg/kg)给药组和LPS+银椴苷高剂量(100 mg/kg)给药组。造模前9天,给药组小鼠每天灌胃给予一次对应剂量的银椴苷,其余组小鼠均给予等体积的0.5%CMC-Na溶液。给药第9天,在灌胃两小时后用3 mg/kg LPS进行腹腔注射以建立内毒素诱导的小鼠急性肺损伤模型,待24 h后进行样本收集。采用血细胞分析仪检测外周血中性粒细胞及单核细胞计数及占比;收集小鼠肺、脾、肝、肾,计算脏器/体重比值;收集左上肺,计算肺组织湿/干重量(W/D)比;苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织结构变化,并进行肺组织病理学评分及测量平均肺泡面积;收集支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF)并采用BCA法检测BALF中蛋白质浓度;实时定量PCR(q RT-PCR)检测肺组织中炎性介质Il-1β、Inos、Il-6和Cxcl-2的m RNA表达水平;Western blot检测肺组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达和AMPKα磷酸化蛋白的表达水平;免疫荧光检测肺组织CD68标记的炎性巨噬细胞浸润以及炎症因子IL-1β的表达。2.细胞实验:构建LPS联合ATP诱导的THP-1巨噬细胞NLRP3炎症小体活化和炎症模型,实验分为control组,LPS+ATP组,以及LPS+ATP+银椴苷(3,10,30μM)给药组。采用Western blot检测THP-1细胞中NLRP3、procaspase-1、pro-IL-1β、AMPKα、p-AMPKα(Thr172)和培养液上清中caspase-1p20和IL-1β的蛋白表达水平;q RT-PCR检测THP-1细胞中炎性细胞因子IL1B、IL6、IL8和TNFA的m RNA表达水平;免疫荧光观察THP-1细胞内NLRP3与ASC共定位情况;Mito SOX标记法检测THP-1细胞线粒体活性氧(mt ROS)的生成;JC-1标记法检测线粒体膜电位的变化情况。结果:1.动物实验:脏器指数结果表明与Vehicle组小鼠相比,LPS处理后显著提高肺、脾、肝脏器指数,而在给予银椴苷(100 mg/kg)干预后肺、脾脏器指数明显下降,同时肝、肾脏器指数也均呈现降低趋势;外周血白细胞分类和计数结果表明小鼠给予LPS刺激后中性粒细胞占比、中性粒细胞数量和单核细胞占比均明显上升,且单核细胞数量也呈现上调趋势,而银椴苷预处理后使得上述各项指标均呈现降低的趋势;HE染色病理形态学检测显示ALI模PS-341临床试验型小鼠肺组织出现肺泡壁和间隔明显增厚、肺内大量炎性细胞浸润、肺组织病理损伤评分升高以及平均肺泡面积减少的现象,而银椴苷干预可明显改善肺组织病理损伤;肺组织W/D检测结果也表明银椴苷显著降低LPS诱导的肺组织水肿;BALF中蛋白含量检测表明,LPS组BALF中蛋白浓度显著上调,而给予银椴苷预处理后其蛋白含量明显降低;q RT-PCR实验结果显示银椴苷明显降低了ALI小鼠肺组织中炎症介质Il-1β、Inos、Il-6和Cxcl-2的基因表达;Western blot结果表明银椴苷显著下调ALI小鼠肺组织中炎症小体相关蛋白pro-caspase-1β、pro-IL-1β、caspase-1 p20的表达并上调p-AMPKα(Thr172)的蛋白表达;肺组织免疫荧光结果显示,银椴苷显著减少了LPS诱导的CD68标记的巨噬细胞浸润、以及炎症因子IL-1β的表达。基于已报道的NLRP3炎症小体和巨噬细胞在急性肺损伤中的关键作用,综合以上实验结果,提示银椴苷可能通过抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的活medication knowledge化、进而改善肺组织炎症反应来抵抗内毒素诱导的小鼠急性肺损伤。2.细胞实验:CCK8细胞毒性实验结果表明在30 h内,银椴苷(0-30μM)剂量对THP-1巨噬细胞活性无影响;Western blot实验结果显示银椴苷呈剂量依赖性地抑制LPS+ATP诱导的THP-1巨噬细胞分泌caspase-1 p20和成熟IL-1β,并且免疫荧光实验结果表明银椴苷显著抑制LPS+ATP诱导的NLRP3和ASC在核周胞质区域的共定位,说明银椴苷显著抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化;q RT-PCR结果显示银椴苷还显著减少LPS+ATP诱导的THP-1巨噬细胞炎症因子IL1B、IL6、IL8和TNFA的m RNA表达水平;mt ROS及线粒体膜电位水平检测结果显示银椴苷显著下调LPS+ATP诱导的THP-1巨噬细胞mt ROS生成以及改善线粒体膜电位的降低。同时,Western blot实验发现银椴苷能够显著上调THP-1巨噬细胞AMPKα的磷酸化水平。基于已报道的AMPK-mt ROS轴在NLRP3炎症小体活化调控中的重要作用,综合以上实验结果,我们推测银椴苷很可能通过增强AMPKα磷酸化进而抑制mt ROS生成并改善线粒体损伤这一途径来抑制巨噬细胞NLRP3炎症小体的活化过程。结论:银椴苷可能通过靶向巨噬细胞AMPK信号通路来抑购买EPZ-6438制mt ROS的生成,从而降低NLRP3炎症小体的活化,进而抑制巨噬细胞介导的过度炎症反应并改善内毒素诱导的小鼠急性肺损伤。