脓毒症是一种临床综合征,表现为宿主对感染的反应失调,导致危及生命的器官功能障碍。目前全球每年大约有1900万人罹患脓毒症,住院死亡率约为26%,尽管经过多方面的努力,近十年病死率有所下降,但是脓毒症仍然是全球面临的巨大健康挑战。近年来的研究发现,脓毒症诱发心肌损伤的患者更容易并发多器官功能衰竭,预后也更为不良。流行病学调查显示,脓毒症诱发心功能障碍的患者约占脓毒症总人数的40%-50%,其病死率可达70%。有效预防、早期诊断和干预脓毒症心肌损害有助于降低脓毒症病死率,改善患者的预后。在正常生理过程中,铁是一种广泛参与代谢和生物功能的活性成分,对许多细胞生命活动具有重要影响。尽管铁的吸收、运输和储存受到人体的严格调控,但在脓毒症时可能发生代谢紊乱,且高水平的铁可导致宿主体内氧化应激增加,从而对细胞和组织造成损害,因此明确脓毒症中铁代谢的改变显得尤为重要。为了探讨铁、脓毒症和心肌病之间的因果关系,我们采用了孟德尔随机化分析方法,利用全基因组关联研究的策略。根据上述研究结果,我们在小鼠脓毒症模型中进行了高铁和低铁饮食的实验,检测了循环中铁参数、炎症指标以及心肌组织铁死亡等相关指标的变化情况,观察铁对脓毒症和心脏功能的影响。同时,我们使用脓毒症心肌细胞损伤模型来探究脓毒症心肌损伤发生的机制。由于肠道及肠道微生物在铁吸收、代谢及脓毒症发病过程中扮演重要角色,因此我们进一步在临床上评估了脓毒症心肌病患者铁参数变化与肠道菌群的相关性。通过这些研究,我们期望为脓毒症心肌病的预防、早期诊断和治疗提供新的理论依据。我们的研究成果有望揭示铁代谢与脓毒症心肌病发生发展的内在联系,为深入理解脓毒症心肌病的发病机制提供科学依据。同时,通过对肠道微生物群的研究,我们可能发现与脓毒症心肌病相关的潜在生物标志物,为临床治疗提供新的靶点。第1章铁与脓毒症心肌病的孟德尔随机化研究及铁对脓毒症心肌病的影响目的:铁稳态对于正常的心脏功能至关重要,越来越多的证据表明,铁失衡是许多心血管疾病亚型的共同特征。为进一步探索铁代谢与脓毒症及脓毒症心功能障碍中潜在的机制。我们首先基于最新的铁参数,脓毒症,心肌病全基因关联分析数据库,使用孟德尔随机化分析他们之间潜在因果关系。随后本研究使用脂多糖(LPS)诱导的脓毒症小鼠模型,探讨铁对脓毒症小鼠心功能的影响及其潜在的发病机制。方法:1、进行双向孟德尔随机化(MR)研究,探寻铁相关参数(血清铁、铁蛋白、转铁蛋白饱和度、转铁蛋白、转铁蛋白受体1)、脓毒症和心肌病之间的潜在因果关系。2、选取约8周龄、雄性C57BL/6J野生型小鼠,分为四组进行研究:空白对照(CON)组、脂多糖(LPS)组、LPS+高铁饮食组和LPS+低铁饮食组。3、记录小鼠死亡率,并利用小动物高频超声检测仪评估小鼠心脏功能的变化。4、使用相关试剂盒评估心脏组织中丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)/氧化型谷胱甘肽(GSSG)的变化。5、最后,应用RT-qPCR和Western blot等方法评估心脏相关基因或蛋白分子的变化。结果:1、孟德尔随机化表明遗传变异预测较高的转铁蛋白饱和度水平与FDR矫正后任何心肌病、肥厚性、肥厚性梗阻性心肌病、肥厚性心肌病合并心力衰竭的风险增加有关。转铁蛋白还显示FDR矫正后肥厚性、肥厚性梗阻性心肌病、肥厚性心肌病合并心力衰竭的风险降低,其他两组经校正后差异无统计学意义。在反向分析中,铁参数不受心肌病的影响。2、动物模型观察LPS或生理盐水干预后1天、2天、7天、14天小鼠的死亡率,发现在7天内死亡率变化最大;LPS联合高铁饮食干预组死亡率最高,基本发生在1-7天内。低铁饮食联合组能增加小鼠的存活率。3、炎症水平的变化如IL-1β、IL-6、TNF-α的水平在LPS组及LPS联合高铁饮食组都明显增加,且联合组的表现更为明显,IL-10的水平在LPS联合高铁饮食组显著下降,这些都表明高铁饮食能显著增加小鼠体循环的炎症水平,并且低铁饮食联合组能有效的降低体循环的炎症状态。4、小鼠模型心脏超声结果显示:LPS组中射血分数(Ejection fraction,EF)及短轴缩短率(Fractional shortening,FS)均值分别为31.53%、16.34%,显著低于CON组(P<0.001),提示脓毒症诱导了心脏功能障碍;而应用高铁饮食干预后后,该数值进一步降低为21.31%、11.68%(P<0.05);在低铁饮食组射血分数及短轴缩短率的损失有所减轻,达到60.29%、31.54%。此外,高铁饮食联合LPS的干预会损害舒张功能,如等容舒张时间(isovolumic relaxation time)、E/A 比值,而低铁饮食能减缓LPS诱导的舒获悉更多张功能的损伤。5、促纤维化的相关mRNA进行RT-qPCR,LPS组心脏组织中COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGFβ、SMAα、水平显著高于CON组以及低铁饮食联合组,这种表现在高铁饮食联合组表现的更为明显。在14天的小鼠超声中,联合高铁组的射血分数及短轴缩短率的仍然存在显著性的下降,而等容舒张时间、E/A比值未见明显差异。6、动物模型心脏组织铁死亡相关特征性指标(PTGS2、GPX4),相比对照组,LPS组心肌组织的铁死亡相关蛋白PTGS2表达增加、GPX4表达下降,而高铁饮食联合组的干预同样也增加了 PTGS2的表达、降低了 GPX4的表达,低铁饮食组此表现较轻。对心肌组织氧化还原相关指标GSH,MDA,GPX活性进行检测,LPS的干预降低GSH的含量,联合高铁饮食进一步降低了 GSH的含量,而低铁饮食组GSH的下降较LPS组减轻。这一现象也能在MDA、GPX的检测中观察到。结论:孟德尔随机化研究提示提高铁的水平能增加人的脓毒症及心肌病的风险。动物模型发现脓毒症小鼠的心功能受损,铁的增加会进一步损伤脓毒症小鼠的心功能。其影响心功能的机制可能是铁稳态失调加重LPS诱导的氧化还原能力的失衡,进一步诱导心肌细胞的铁死亡。第2章铁代谢紊乱及铁死亡与脂多糖诱导脓毒症心肌细胞损害机制的探索目的:心肌细胞富含线粒体,然而目前线粒体中铁代谢对脓毒症心肌损伤的影响并不清楚。线粒体铁稳态是维持心肌细胞正常生命活动的重要因素。在脓毒症的动物模型中,铁代谢紊乱会导致心肌细胞功能障碍及铁死亡。考虑到线粒体中铁代谢的重要性,我们在脓毒症的细胞模型上探索胞质和线粒体铁代谢变化及诱导铁死亡的机制。方法:1、使用一系列脂多糖(LPS)浓度梯度(0-20 μg/ml)处理HL-1心肌细胞24小时。2、通过检测铁死亡相关标志物PTGS2和GPX4,以及应用铁死亡特异性抑制剂Ferrostatin-1进行评估心肌细胞铁死亡的情况。3、使用免疫荧光JC-1、Liperfluo和DCFH-DA探针评估心肌细胞线粒体膜电位、脂质过氧化和活性氧的变化情况。4、使用FerroOrange和Mito-FerroGreen探针评估胞质和线粒体内亚铁离子的变化情况。5、通过检测BECN1、LC3BⅡ和LC3BⅠ蛋白评估心肌细胞自噬的变化情况。6、评估影响心肌细胞铁代谢的关键蛋白FTH1、FTMT和MFRN1的变化情况。7、为了探讨氧化应激在铁死亡中的作用机制,我们使用去铁胺(DFO)、N-乙酰半胱氨Fer-1抑制剂酸(NAC)和Mito-TEMPO(一种线粒体抗氧化剂)进行了处理。8、通过检测核受体辅激活因子4(NCOA4)以及应用泛素化抑制剂MG132,我们评估了线粒体铁蛋白的降解方式。9、最后,我们使用慢病毒过表达心肌细胞线粒体铁蛋白,并使用线粒体自噬激活剂CCCP评估了线粒体铁蛋白对线粒体自噬的影响。结果:在该研究中,用LPS建立了一种脓毒症心肌损伤模型,并观察了 LPS对心肌细胞的影响。LPS干预后,PTGS2mRNA表达逐渐增加,GPX4表达逐渐降低,提示心肌细胞可能发生铁死亡。铁死亡抑制剂能够逆转心肌细胞的存活率的下降。进一步观察发现,LPS也影响了心肌细胞的铁代谢,使得胞质和线粒体的铁离子水平增加。过表达FTMT(线粒体铁蛋白)能够降低亚铁离子水平并部分逆转心肌细胞的死亡。此外,LPS还能激活心肌细胞的自噬,自噬参与了心肌细胞内铁代谢途径。NALPA genetic variantsC能降低心肌细胞的自噬水平,与TEMPO一样能增加心肌细胞的存活率,而DFO的干预未能降低自噬的水平。联合使用NAC、TEMPO和单独抑制自噬的心肌细胞存活率相比,也未见显著性的改善。进一步的实验发现,FTMT的降低是通过NCOA4介导的自噬性降解而不是泛素化介导的蛋白降解。此外,LPS能增加线粒体铁转运蛋白的表达,这些表明LPS参与了心肌细胞线粒体的铁运输和铁储存。PINK1及Parkin的表达增加,说明线粒体自噬发生激活。而FTMT过表达能降低PINK1、Parkin的表达,表明FTMT能抑制自噬。线粒体自噬的激活剂CCCP增加了心肌细胞的铁死亡标志物的表达及降低了心肌细胞活力,表明FTMT也能通过作用线粒体的自噬影响心肌细胞的铁死亡。结论:LPS可诱导心肌细胞内铁的运输和储存过程紊乱,同时影响线粒体铁代谢,导致心肌细胞铁代谢紊乱及铁死亡。抑制线粒体铁代谢紊乱可部分逆转LPS诱导的心肌细胞铁代谢紊乱及铁死亡。第3章铁代谢与肠道微生物群失调及脓毒症心肌病的关系目的:肠道是铁吸收和代谢的最重要的场所,目前已证实微生物群在脓毒症中的作用,但鲜有研究报道肠道微生物群和铁代谢在脓毒症心肌病中的变化和作用。该部分研究旨在探索肠道微生物群及铁代谢在脓毒症心肌病的变化和相关性。方法:本研究为单中心观察性研究,选取了 2022年2月至2022年9月期间收治于苏北人民医院重症医学科的脓毒症患者。符合入选标准的患者在第1天、第3天和第7天时采集血液和粪便样本。血液样本用于检测铁代谢水平,粪便样本进行16S rDNA测序以评估肠道微生物多样性。入选的患者在72小时内进行超声心动图检查,根据超声结果将患者分为脓毒症心肌病组和非脓毒症心肌病组。收集两组患者的临床数据,包括年龄、性别、身体质量指数(BMI)、序贯器官衰竭评分(SOFA)和急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)等基本信息。比较两组患者的肠道微生物多样性、铁代谢水平、28天病死率、ICU住院时长、总住院时长、以及血管活性药物使用强度等。结果:研究期间入组患者共有48例,其中脓毒症心肌病组有23例,非脓毒症心肌病组有25例。患者的基线特征比较结果表明,两组患者的年龄、SOFA评分、APACHEII评分、肌钙蛋白 Ⅰ(cardiac TroponinI,cTnⅠ)、B 型钠尿肽(B-type Natriuretic Peptide,BNP)、降钙素原(procalcitonin,PCT)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)等均无统计学意义(P>0.05)。但是两组患者的中心静脉压(Central Venous Pressure,CVP)、乳酸(Lactate,Lac)水平等存在统计学差异(P<0.05),且脓毒症心肌病组均高于非脓毒症心肌病组。对两组患者铁代谢水平分析,结果显示,两组患者入组第1天和第3天铁蛋白(serum ferritin,SF)水平存在统计学差异(P<0.05),且脓毒症心肌病组的SF水平均高于非脓毒症心肌病组。其他铁代谢水平包括第1、3、7天的血清铁(serum iron,SI)、转铁蛋白(serum transferring,TRF)、转铁蛋白饱和度(transferrin saturation,TSAT)、总铁结合力(total ironbinding capacity,TIBC)等均无统计学意义(P>0.05)。对两组患者肠道微生物群丰富度及多样性分析,结果显示两组患者的ACE指数和Chao1指数存在统计学差异(P<0.01),而Shannon指数和Simpson指数无统计学差异(P>0.05)。进一步评估两组患者与时间相关的肠道微生物群Alpha多样性,发现脓毒症心肌病组第7天的Simpson指数较第1天下降,且存在统计学差异(P<0.05)。对两组患者肠道微生物群Beta多样性进行分析,PCoA分析提示存在显著差异(P<0.01)。我们比较两组患者不同分类水平上的肠道微生物群组成,在门水平上,脓毒症心肌病组中放线菌(Actinobacteria)(P=0.018)和一种未知细菌(unidentified_Bacteria)的丰度(P=0.024)较低。科水平上,脓毒症心肌病组中气单胞菌科(Aeromonadaceae)的丰度较低(P=0.023)。属水平上,枸橼酸杆菌属(Citrobacter)在脓毒症心肌病中更丰富(P=0.007)。物种层面上,诺德拟杆菌(Bacteroides_nordii)(P=0.037)和速生梭菌([Clostridium]_celerescens)(P=0.026)在脓毒症心肌病中更丰富。通过LEfSe分析,我们发现肠杆菌(Enterobacter)和夸氏肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella_quasipneumoniae)可能是脓毒症心肌病特定的肠道微生物(LDA评分=4.2747,P=0.003)。通过临床指标与肠道微生物群的Spearman等级相关分析,我们发现多形拟杆菌(Bacteroides_thetaiotaomicron)与BNP、SI、TSAT呈正相关(P<0.05)。脆弱拟杆菌(Bacteroides_fragilis)与 cTnⅠ、TRF、TIBC 呈负相关(P<0.05)。解糖胨普雷沃菌(Prevotella_disiens)和提蒙普雷沃菌(Prevotella_timonensis)与SF呈负相关(P<0.05)。本次研究的次要观察指标,包括患者的28天病死率、ICU住院时长、总住院时长、机械通气率、连续性肾脏替代治疗(C ontinuous renal replacement therapy,CRRT)使用率、血管活性药物使用强度、入组24小时液体使用量等均无统计学差异。结论:我们的研究表明,铁蛋白可能对早期识别脓毒症心肌病有预测价值,同时肠杆菌科可能是脓毒症心肌病特定的肠道微生物群。此外,肠道微生物群多样性的改变影响铁代谢的变化,最终可能诱导脓毒症心肌病的发生,未来还需要进行更大规模的研究来验证。