肿瘤坏死因子(TNF)SAHA配制相关凋亡诱导配体(TRAIL)是TNF超家族的一员。TRAIL能够通过与受体(TRAILR)结合选择性诱导肿瘤细胞的凋亡,并且几乎不存在全身毒性。因此,在寻找理想的肿瘤治疗药物的过程中,TRAIL迅速引起人们的兴趣。目前已开发出多种针对TRAIL-TRAILR的候选抗肿瘤药物,其中多个重组可溶性TRAIL蛋白药物已进入临床试验阶段。遗憾的是,临床实验中并没有显示出显著的抗肿瘤活性,导致失败的原因,包括耐药性、脱靶毒性、半衰期短等。为了解决这些弊端,研究人员通过生物工程获得更稳定的三聚体形式重组TRAIL,利用纳米材料进行靶向递送,以及利用载体表达TRAIL基因进行基因治疗等,但尚未进一步推动TRAIL的临床应用。TRAIL除了能特异性诱导肿瘤细胞凋亡外,对炎症和自身免疫模型的研究表明,TRAIL可以通过许多不同的方式影响免疫细胞。虽然TRAIL最初被发现是在自然杀伤(NK)细胞或细胞毒性T细胞的肿瘤防御中具有重要作用,但TRAIL对调节性T细胞(Tregs)、效应T细胞、中性粒细胞和抗原提呈细胞的附加作用也成为人们关注的焦点。尽管目前已有一些研究报道了重组TRAIL能够通过诱导Tregs等免疫细胞凋亡影响肿瘤免疫微环境,但其在肿瘤微环境(TME)中潜在的调节作用和机制尚不清楚。研究重组TRAIL在TME中的免疫调节作用和机制可能会提供一个重要的视角去理解重组TRAIL的临床耐药,并有助于探索更有效的肿瘤治疗策略。由于人源TRAILR和鼠源TRAILR存在结构差异,人源TRAIL对鼠源TRAILR的亲和力较弱,为了能够更好的在免疫全能鼠中评价重组TRAIL在肿瘤免疫微环境中的调节作用和机制,本论文首先构建并纯化得到可溶性鼠源TRAIL(sm TRAIL)用于鼠源系统中的评价。在体外,通过细胞杀伤实验确定了鼠乳腺癌细胞4T1为sm TRAIL的敏感细胞系,结直肠癌细胞CT26和黑色素瘤细胞B16为sm TRAIL的非敏感细胞系。以上述三种细胞在免疫全能小鼠中建立肿瘤模型,参考TRAIL临床试验中的治疗浓度,选择0.5 mg/kg、2 mg/kg、8 mg/kg sm TRAIL三种剂量进行治疗。但值得注意的是,肿瘤治疗效果并未呈现剂量依赖,2 mg/kg sm TRAIL治疗组不管是敏感细胞系还是非敏感细胞系中都展现出最好的肿瘤治疗效果;而8 mg/kg sm TRAIL组治疗效果较差甚至表现出促肿瘤生长的作用。通过免疫组化对肿瘤组织内caspase检测可知,不同剂量的sm TRAIL能够诱导4T1细胞的凋亡但诱导CT26和B16细胞的凋亡能力较弱,这说明在肿瘤治疗过程中,除了凋亡作用还存在其它因素(如免疫调节)影响了sm TRAIL在体内的抗肿瘤效应。接下来,我们选择sm TRAIL敏感细胞4T1及非敏感细胞CT26作为研究模型,通过流式细胞术对小鼠肿瘤组织中的免疫细胞进行分析,检测发现:2 mg/kg sm TRAIL可激活先天性免疫细胞和CD8~+T细胞;而8 mg/kg sm TRAIL会抑制NK细胞和CD8~+T细胞的活化,并显著增加M2样巨噬细胞的浸润数量。同时,我们分别对4T1和CT26小鼠肿瘤模型的肿瘤进行转录组测序及单细胞RNA测序,测序得到的结论与流式检测的结果相一致,进一步印证不同剂量sm TRAIL对瘤内的免疫细胞会产生不同的调节作用,进而影响肿瘤生长情况。我们还分别在蛋白水平以及转录水平对两种肿瘤模型瘤内的细胞因子表达进行了检测,结果显示:2mg/kg sm TRAIL可促进IL-12、IFN-γ的表达,8 mg/kg sm TRAIL会使IL-10、VEGF的表达增高。结合免疫细胞浸润和激活结果可知,2 mg/kg sm TRAIL治疗有利于免疫激活,实现肿瘤杀伤;而8 mg/kg sm TRAIL组则促进免疫抑制微环境的生成,抵消sm TRAIL对肿瘤细胞的凋亡作用。随后,我们着重探究了8 mg/kg sm TRAIL治疗引发免疫抑制的机制。首先,通过体内体外实验验证了sm TRAIL对NK细胞的抑制作用,结果发现,NK细胞在sm TRAIL的肿瘤治疗中至关重要,但NK细胞的活化受到抑制并不是sm TRAIL直接作用于NK细胞导致。随后,我们对sm TRAIL对肿瘤细胞的影响进行了探究,结medical demography果显示,sm TRAIL通过TRAIL-TRAILR轴可以诱导肿瘤细胞分泌CCL2,阻断TRAIL-TRAILR轴可以有效控制瘤内CCL2的分泌,并抑制肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的招募,进而使得8 mg/kg sm TRAIL组显著抑制肿瘤的生长。单细胞RNA测序等结果也表明,8 mg/kg sm TRAIL治疗可促进M2样巨噬细胞的募集。此外,我们还发现sm TRAIL对巨噬细胞也会产生直接作用促进M2样巨噬细胞的极化。sm TRAIL与巨噬细胞表面的TRAILR结合后,使得胞内Fox O1表达增多,Fox O1与IL-10启动子结合,促进IL-10的分泌。对8 mg/kg sm TRAIL治疗引发的免疫抑制机制进行总结:sm TRAIL与肿瘤细胞的TRAILR结合后,诱导肿瘤细胞分泌CCL2,CCL2对CCR2~+TAMs进行招募;同时sm TRAIL还可以直接作用于TAMs,促进M2样TAMs的极化以及IL-10的分泌,进一步促进免疫抑制微环境的形成,从而抑制了肿瘤微环境中NK细胞和CD8~+T细胞的激活和功能。最后,我们在免疫系统人源化小鼠模型(HU-HSC-NPG.GM3)中评价了重组可溶性人源TRAIL(sh TRAIL)的抗肿瘤效果及免疫调节作用,结果显示,2mg/kg和8 mg/kg sh TRAIL都能显著抑制人结直肠癌细胞HCT116的生长,而8mg/kg sh TRAIL会使得瘤内Tregs和M2样巨噬细胞的数量增多,导致其与2 mg/kg sh TRAIL治疗组相比没有更好的治疗效果。sh TRAIL在TME中的调节作用与sm TRAIL的作用相似,都是通过增加瘤内的M2样巨噬细胞而产生免疫抑制作用,为解除这种免疫抑制,我们将sh TRAIL与巨噬细胞靶向药物曲贝替丁(trabectedin)进行联合用药。联合治疗组能够显著提升淋巴细胞及激活的CD8~+T细胞的浸润,显著减少瘤内Tregs和M2样巨噬细胞的数量,重塑了肿瘤免疫微环境,增强了瘤内抗肿瘤免疫作用,提升了sh TRAIL的抗肿瘤效果。综上所述,本论文在不同小鼠肿瘤模型中全面地评估了sm TRAIL的抗肿瘤效果以及对瘤内多种免疫细胞的影响,发现sm TRAIL在免疫功能正常的小鼠肿瘤模型中具有与剂量相关的免疫调节作用,并对其在肿瘤微环境中的免疫调节机制进行了探究。同时,在人源化小鼠肿瘤模型中使用sh TRAIL验证了其抗肿瘤效果及其免疫调节作用,并通过联合化药进一步放大抗肿瘤效应及激活机体抗肿瘤免疫。论文关于重组TRAIL在肿瘤微环境中免疫调节机制的探究,为TRAIL的进一步临床应用提供了重要基础和依据,并对TRABLZ945细胞培养IL与化药及免疫治疗药物的联合治疗策略优化具有一定的指导意义。