粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)是一种重要的条件致病菌,会引起人和动物发生严重的肺炎、角膜炎、败血症等疾病,主要通过分泌大量胞外水解酶参与其致病作用,如蛋白酶、几丁质酶、核酸酶等。粘质沙雷氏菌不仅分泌一种分子量为27 k Da的核酸酶Nuc A,其核酸酶活性在50℃加热15分钟后完全失活;还分泌另一类核酸酶,即沙雷氏蛋白酶(Serralysin and serralysin like proteases),分子量在50-70 k Da之间,部分蛋白能耐受90℃高温。为探究S.marcescens 6M-6所分泌的耐高温核酸酶,试验通过粗酶液沉淀、离子层析及纯化以及异源表达等技术成功鉴定并纯化具有核酸酶活性的serralysin like protease D(SPD),并对其酶学特性、核酸酶结构域以及体外对中性粒细胞活性、细胞因子、胞外诱捕网的影响展开探索,具体如下。试验一粘质沙雷氏菌胞外核酸酶的鉴定及原核表达采用硫酸铵沉淀、DEAE-阴离子交换层析、Native-PAGE、以及90℃加热处理并结合质谱分析技术,成功鉴定出S.marcescens 6M-6分泌的三个核酸酶,属沙雷氏蛋白酶家族成员,分别命名为SM、SPB、SPD。以S.marcescens 6M-6基因组为研究对象,通过表达载体p ET-28a(+)、p Cold I、p ET-28a(+)-SUMO以及大肠杆菌BL21(DE3)plys S对SPD蛋白进行异源表达及纯化;同时通过p ET-28a(+)载体以及大肠杆菌BL21(DE3)plys S对SM、SPB蛋白进行异源表达及纯化。结果:(1)SPD蛋白主要以包涵体蛋白形式表达,并进一步通过镍柱亲和层析、包涵体变性、复性等步骤成功获得了具有核酸酶活性Dolutegravir化学结构的高纯度重组SPD蛋白。其中,在p ET-28a(+)和p ET-28a(+)-SUMO载体中,SPD蛋白最佳表达条件为37℃、1 m M IPTG、5 h;在p Cold I载体中,SPD蛋白最佳表达条件为16℃、1 m M IPTG、5 h。(2)参考获得重组SPD蛋白的方法,成功获得具有核酸酶活性的重组SM及SPB蛋白。上述结果表明,粘质沙雷氏菌能分泌多个具有核酸酶活性的蛋白,包括有SM、SPB、SPD等。试验二重组SPD蛋白的酶学特性研究进一步研究了温度、p H、金属离子(如Mg~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)等)、温度预处理对重组SPD蛋白水解核酸和酪蛋白活性的影响。1.SPD蛋白核酸酶学特性结果:(1)重组SPD蛋白具有降解不同类型的DNA片段,包括线性双链DNA(纯化的PCR产物)、环状质粒DNA(p ET-28a(+)载体)以及染色体DNA(大肠杆菌基因组DNA)的作用,但不能降解RNA(MDBK细胞),表明该蛋白是一种非特异性脱氧核糖核酸酶。(2)重组SPD蛋白降解线性双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA)的温度范围为37-50℃(最适温度为50℃),p H范围为7.3-10.0(最适p H为10)。(3)Mg~(2+)具有增强重组SPD蛋白核酸酶活性的作用,最佳浓度为5 m M;Zn~(2+)、Cu~(2+)以及Ca~(2+)(浓度达1 m M以上)具有抑制重组SPD蛋白核酸酶活性的作用,而0.5 m M的Ca~(2+)则具有增强重组SPD蛋白核酸酶活性的作用;Mn~(2+)则对重组SPD蛋白的核酸酶活性没有影响。2.蛋白酶学特性结果:重组SPD蛋白降解酪蛋白的反应温度为37-50℃,p H范围为7.3-10(最适p H为7.3)。3.温度稳定性实验结果:重组SPD蛋白在-20到50℃温度范围放置10min,对其核酸酶活性和蛋白酶活性均无不良影响。试验三SPD蛋白核酸酶结构域的研究序列分析表明沙雷氏蛋白酶SPD、SM、SPB与目前已知的核酸酶没有同源性,提示它们可能是核酸酶家族的新成员。1.通过p ET-28a(+)载体和大肠杆菌BL21(DE3)plys S分别对SPD蛋白的N-端Zn~(2+)结合金属蛋白酶催化结构域和C-端Ca~(2+)结合结构域进行截短表达,并研究相应截短蛋白的核酸酶活性或蛋白酶活性:(1)成功构建了截短蛋白SPD_(1-306)(MW:33 k Da)和SPD_(307-538)(MW:25 k Da),其中SPD_(1-306)蛋白具有较弱的核酸酶活性和蛋白酶活性,而SPD_(307-538)蛋白无明显酶活性,表明SPD蛋白的双酶活性结构域均在N-端,而非C-端。(2)SPD_(1-306)蛋白在透析复性过程中极易沉淀且不稳定,表明C-端结构域对SPD蛋白结构的稳定起重要作用。2.鉴于许多双功能酶共享同一催化活性中心,进一步检测了保守金属蛋白酶催化基序HEXXHXXGXXH在SPD蛋白核酸酶功能中的作用;通过重叠PCR及原核表达分别在大肠杆菌BL21(DE3)plys S中构建4个重组SPD突变体蛋白(H234A、E235A、H238A、H244A),其蛋白酶活性均丧失而核酸酶活性不受影响。可见催化基序HEXXHXXGXXH仅是SPD蛋白的蛋白酶催化中心。试验四重组SPD蛋白对中性粒细胞活性、细胞因子以及胞外诱捕网的影响采用Percoll法从BALB/c小鼠的骨髓中提取原代中性粒细胞,通过流式细胞术检测中性粒细胞表面标志物Ly6G、CD11b以鉴定细胞纯度;CCK-8(Cell Counting Kit-8)检测重组SPD及其相关蛋白对中性粒细胞活性的影响;ELISA检测重组SPD及突变体蛋白对中性粒细胞炎症因子释放的影响;免疫荧光染色和SYTOX Green胞外DNA定量检测Oncology Care Model佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)和S.marcescens对中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil Extracellular Traps,NETs)形成的影响以及重组SPD蛋白及其相关蛋白对NETs的降解作用。结果:(1)用10μg/m L、200μg/m L的SPD或SPD_(1-306)孵育1 h,中性粒细胞的存活率均呈下降ABT-199使用方法趋势;而用50μg/m L、100μg/m L孵育,中性粒细胞相对活性呈增强趋势。表明SPD或SPD_(1-306)蛋白对中性粒细胞的活性及存活率的影响与其作用浓度及时间有关。而SPD_(307-538)以及突变体蛋白(H234A、E235A、H238A、H244A)对中性粒细胞的活性及存活率均无影响。综上表明,N-端结构域是SPD蛋白影响中性粒细胞活性及存活率的关键区域。(2)SPD蛋白作用中性粒细胞具有促进IFN-γ、IL-4、IL-6释放,抑制IL-10和IL-1β的作用,而E235A则仅有促进IFN-γ释放,抑制IL-1β的作用;表明SPD及E235A蛋白具有干扰中性粒细胞炎症因子释放的作用。(3)不同浓度(>50n M)的PMA和不同感染复数(Multiplicity of infection,MOI)(MOI=10、100、1000)的S.marcescens在不同诱导时间(1、3、5 h)均能诱导NETs的形成。(4)重组SPD、SPD_(1-306)及E235A蛋白对PMA和S.marcescens诱导形成的NETs具有降解作用,而SPD_(307-538)蛋白则无降解作用;表明N-端结构域是SPD蛋白发挥降解NETs的关键区域。(5)研究还发现,重组SM和SPB蛋白也具有影响中性粒细胞活性和降解NETs的能力,表明具有双酶活性(核酸酶活性和蛋白酶活性)的沙雷氏蛋白酶可能是细菌与中性粒细胞作用的重要介质。结论:1.来自S.marcescens 6M-6的沙雷氏蛋白酶SPD、SM和SPB是一种具有核酸酶和蛋白酶活性的双功能酶。2.重组SPD蛋白具有Mg~(2+)依赖性的DNA酶活性,其核酸酶活性最适反应温度为50℃,最适p H为10;蛋白酶活性反应温度为37-50℃,最适p H为7.3。3.SPD蛋白的核酸酶活性和蛋白酶活性均是通过其N-端催化结构域发挥作用的,催化基序HEXXHXXGXXH仅是其蛋白酶催化中心。4.重组SPD蛋白具有影响中性粒细胞活性、干扰中性粒细胞细胞因子释放以及降解NETs的能力。5.重组SM和SPB蛋白也具有影响中性粒细胞活性和降解NETs的能力,表明具有双酶活性(核酸酶活性和蛋白酶活性)的沙雷氏蛋白酶可能是细菌与中性粒细胞作用的重要介质。