类风湿性关节炎是一种常见的自身免疫性疾病,其特征为持续性滑膜炎并伴随剧烈疼痛,严重者导致功能损害和残疾。患者体内表现为免疫细胞的浸润和多种促炎细胞因子的表达。肿瘤坏死因子α(TNF-α)是由157个氨基酸残基组成的三聚体可溶性NVP-TNKS656蛋白,位于多种促炎因子的顶端,是免疫调节的中枢因子,实现炎症的启动和维持,在类风湿性关节炎的发病机制中占主导地位,是治疗类风湿性关节炎的重要治疗靶点。研究表明,饮用绿茶有利于遏制自身免疫性疾病的发生发展。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是绿茶中含量最丰富和活性最强的小分子化合物,具有显著的抗氧化和抗炎特性,已被证明能够改善类风湿性关节炎的症状。然而,EGCG以TNF-α为治疗靶点与其相互作用改善类风湿性关节炎的研究尚不深入。因此,本研究拟通过对重组TNF-α蛋白进行表达与纯化,获得高纯的TNF-α蛋白,进而探究EGCG与TNF-α蛋白的相互作用来改善类风湿性关节炎的作用机制。实验室前期已成功构建了表达TNF-α的表达质粒(p ET28-TNF-6His)。本研究首先将该重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中并进行目的蛋白的表达;优化目标蛋白的表达条件;在通过亲和层析等纯化技术,得到了高纯度的重组TNF-α蛋白。在此基础上,采用表面等离子共振(SPR)技术检测EGCG与TNF-α/TNFR1/TNFR2之间相互作用关系,通过L929细胞和293-NF-κB报告细胞,采用细胞毒性实验分析、荧光素酶报告基因方法分析,探究EGCG对TNF-α活性的影响。选用类风湿性关节炎成纤维样滑膜细胞RA-HFLS为细胞模型,采用MTT和蛋白免疫印迹(Western Blot)方法探究EGCG对RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NRoxadustat纯度F-κB信号通路活化和细胞增殖的影响。主要研究结果如下:(1)琼脂糖凝胶电泳结果显示,p ET28-TNF-6His质粒成功转Cell Biology化到大肠杆菌BL21(DE3)中;(2)SDS-PAGE电泳结果显示,大肠杆菌BL21(DE3)能成功表达出TNF-α蛋白;(3)为了优化重组蛋白TNF-α的诱导表达条件,对诱导剂种类、诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间四个方面进行探究。最优表达条件为0.1 m M IPTG为诱导剂、28℃诱导12 h;(4)通过Ni-NTA亲和层析柱使蛋白分离纯化,成功纯化出浓度为1.62μg/μL、纯度高达96%的重组TNF-α蛋白;(5)在分子互作水平上,EGCG能够同TNF-α、TNFR1和TNFR2直接结合,具备相似的浓度亲和力,进而阻断TNF-α与其受体TNFR1、TNFR2之间的结合;(6)EGCG能够显著抑制TNF-α诱导的L929细胞凋亡,并且这种作用不是由于细胞毒性产生的;(7)EGCG可抑制293-NF-κB报告细胞中TNF-α诱导的NF-κB信号通路的活化;(8)EGCG能够抑制RA-HFLS细胞中TNF-α介导的NF-κB信号通路,遏制相关标志蛋白(IKKα/β、IκBα、P65)的活化。综上所述,本研究通过重组蛋白的表达与纯化技术,成功得到TNF-α重组蛋白。发现EGCG能同TNF-α蛋白及其受体直接结合,破坏TNF-α同TNFR1与TNFR2之间的相互作用,抑制TNF-α诱导的NF-κB信号通路在RA-HFLS细胞中活化,进而遏制了炎症的过度活化,从而改善类风湿性关节炎的发生发展。因此,日常饮用绿茶中EGCG可能是预防性治疗TNF-α相关炎症疾病的潜在保健食品。