芸苔素内酯(brassinolide,BL)是天然芸苔素甾类化合物中活性最高的化合物。二十世纪三十年代,美国农业部下属的研究机构开始研究花粉中的植物激素成分,经过四十余年的持续努力,最终在七十年代末从花粉中分离出纯的BL并确定了其化学结构。然而,由于BL在植物中含量极低,且缺乏可以规模供应的前体物质,至今仍未能实现量产。近年来,合成生物学技术的快速发展使得利用微生物细胞工厂大量合成稀有天然产物或其半合成前体(如BL及其合成前体)成为可能。酿酒酵母因具有生物安全性高、基因编辑等遗传操作工具丰富,成为合成生物学的最佳底盘细胞之一。本研究通过比较现有BL类似物的合成途径以及合成前体如麦角甾醇、豆甾醇以及海百合甾醇等的侧链结构,提出24-表-麦角甾醇可以作为BL半合成的前体,并采用酿酒酵母为底盘细胞创制规模化制备24-表-麦角甾醇的人工细胞工厂,以期实现BL的商业应用。首先,构建24-表-麦角甾醇人工合成途径。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在敲除ERG4的酵母中引入来源于不同植物的Δ24(28)-甾醇还原酶DWF1,液相分析发现了新产物的生成,并进一步通过质谱和核磁验证,确定其为24-表-麦角甾醇。其中,引入来源于匍匐筋骨草(Ajuga reptans,Ar)的ArDWF1的重组菌,其24-表-麦角甾醇产量最高,达到13.79 mg/L。在此基础上,采用定向进化提升ArDWF1的催化活性。基于缺乏麦角甾醇的菌株表现出表型缺陷的现象,采用含有YPD/HygB+0.025%SDS的培养基作为筛选培养基,开发了 DWF1的高通量筛选方法。将ArDWF1基因突变体片段(易错PCR)与线性化表达质粒共转化酵母菌(erg4Δ),通过胞内同源重组组装突变体表达质粒,构建突变文库,经过高通量筛选和液相复筛,得到正向突变点。采用DNA shuffling,对获得的正向突变点进行组合,从而获得最佳突变体Ar207(V143G/S306P/Y338H),与ArDWF1相比,携有突变体的重组菌的24-表-麦角甾醇产量提高至3.46倍。然后,通过调控甾醇稳态,促使甾醇代谢流顺畅地向下游流动,提升甾醇的积累量。对2个编码甾醇酰基转移酶的基因(ARE1和ARE2)和3个编码甾醇酯水解酶的基因(YEH1、YEHH2和TGL1)分别进行了敲除、过表达和组合过表达操作,分析其对胞内甾醇稳态和代谢产物合成的影响,发现过表达酰基转移酶(ARE2)和水解酶(YEH1和/或YEH2)的组合,能产生一种协同效应,重构了甾醇稳态,特别是YQE717(ARE2-YEH1-YEH2)菌株,合成了 71.04 mg/L的24-表-麦角甾醇和220.07 mg/L的晚期甾醇(具有Δ5,7结构的甾醇),分别是未调控菌株的1.65倍和2.09倍。最后,强化途径基因,实现24-表-麦角甾醇的高选择性、高滴度制备。通过筛选不同类型的启动子调控Ar207的表达,确定采用诱导型GAL1启动子(PGAL1),增early antibiotics强Ar207在发酵中后期(乙醇补料阶段)的转录水平。进一步过表达脂肪酸合成途径关键酶ACC1后,细胞储存甾醇的能力增强,产量又略有提高。但是,由于Ar207的启动子替换为PGAL1后,24-表-麦角甾醇的另一前体,24-表-麦角甾-5,7-二烯-3β-醇积累明显,因此进一步过表达了编码甾醇C-22脱氢酶的基因ERG5,以促进该前体的转化。最终构建得到的YQE734菌株,通过补料分批发酵,24-表-麦角甾醇的产量提升至2.76 g/L,在晚期甾醇()中的占比提升至84.2%。此外,本研究还以产24-表-麦角甾醇的重组菌为出发菌,借鉴BL合成途径,尝试构建具有(22R,23R)-22,23-双羟基侧链的GSI-IX化学结构24-表-麦角甾醇衍生物的合成途径。敲除ERG5并引入拟南芥来源的甾醇C-22羟基化酶、甾醇C-23羟基化酶和P450s还原酶,经液相及质谱分析,确定(22R,23R)-22,23-双羟基-7-脱氢-菜油甾醇(22,23-diOH-Δ7-CR)人工合成途径构建成功。通过调整途径中基因的转录水平、截短AtCPR1的方法,补料分批发酵时22,23-diOH-Δ7-CR的产量达到100.60 mg/L。本研究借助酿酒酵母自身Q-VD-Oph浓度的麦角甾醇合成途径,构建BL化学合成前体——24-表-麦角甾醇的人工合成途径;采用蛋白质工程、甾醇稳态工程和高密度发酵,提高了 24-表-麦角甾醇的产量,为BL的量产奠定了基础;最后,还构建了产侧链双羟基化24-表-麦角甾醇衍生物的酿酒酵母细胞工厂,并进行了初步优化。