原位牙周组织工程技术是指通过生物材料或复合生长因子创造适宜体内种子细胞增殖、分化的微环境,激发机体自身的牙周修复潜能来促进牙周组织重建,是牙周组织再生研究的新方向。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周再生的主要功能细胞,亦是原位组织工程技术诱导再生的主要靶细胞,其成骨活性受炎性微环境的影响。巨噬细胞极化和T细胞分化失衡等免疫因素是影响牙槽骨稳定的重要因素。因此,理想的牙周再生策略需具备抗炎、免疫调节和促成骨分化等多种功能。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)因兼具多种生物活性而受到我们关注。课题组前期研究证明外源性PGRN在牙周炎的治疗中显示出免疫调节及促成骨功能,提示其可能是促进牙周再生的重要因子。但与其他生物活性因子一样,PGRN半衰期较短且易被多种酶降解。因此,探索适当的支架材料作为控释系统是实现将PGRN应用于牙周组织再生领域中亟待解决的问题。理想的原位组织工程支架材料不仅应具有良好的生物相容性,而且也需具备促成骨活性和免疫调节作用。水凝胶是一类具有三维网络结构的生物材料,因其与体内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)相似,故能够模拟天然组织的ECMs,较其他形式材料具有更好的仿生性。在牙周组织工程中,可注射水凝胶既可高度适应牙周的不规则创面结构,又可为牙周袋内定期注射进行微创治疗提供可能性。天然生物大分子透明质酸(hyaluronic acid,HA)与羧甲基壳聚糖(carboxymethyl chitosan,CMCTS)因具有优良的生物医学特性常被应用于生物工程支架、药物载体和生物敷料。将HA部分糖环中引入醛基是实现CMCTS-HA自交联形成可注射性水凝胶的简便有效新途径,然而这种基于动态亚胺共价键交联的复合水凝胶尚未应用于牙周骨缺损领域。本研究针对该支架材料在牙周炎性骨缺损中的作用和将其作为PGRN的控释载体展开研究。拟在明确CMCTS生物活性的基础上,制备醛基化HA,使其与CMCTS的氨基直接共价交联,制备可注射性原位自交联水凝胶。进而系统研究其负载PGRN的促成骨分化及免疫调节作用,以期为原位牙周组织工程中生长因子和支架材料的选择提供有益参考。材料和方法:1.羧甲基壳聚糖/甲壳素对牙周膜干细胞增殖和成骨分化的作用分别采用CMCTS和羧甲基甲壳素(carboxymethylchitin,CMCT)处理人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)。通过检测细胞活力、多向分化能力和矿化能力等指标,以及经典成骨相关因子碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、Runt 相关转录因子 2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)和骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)的基因及蛋白的表达水平,分析CMCTS和CMCT对hPDLSCs的增殖和成骨分化能力的影响。2.可注射性原位动态水凝胶CA的制备、表征及促成骨活性研究以HA为原料,通过高碘酸钠氧化制备醛基化透明质酸(hyaluronic acid aldehyde.HAD),并通过斐林试剂检测及红外光谱表征确定醛基的形成。通过双联注射器混合挤推HAD与CMCTS制备原位水凝胶CA,系统研究不同氧化度HAD与CMGenetic alterationCTS交联制备水凝胶的化学结构、微观形貌、流变学性质、自愈合能力、细胞相容性、组织相容性以及促成骨等性能,筛选出用于后续负载生物活性因子的可注射性水凝胶。3.CA负载PGRN在炎性牙周骨缺损再生及免疫调节中的作用利用CMCTS和HAD2两者混合制备原位水凝胶CA,并通过冻干压实得到CA冻干膜片,以牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)为对照检测CA水凝胶和冻干膜对PGRN因子的缓释作用;体外研究CA联合PGRN对hPDLSCs的成骨诱导作用,并将其植入大鼠颅骨缺损模型,通过Micro-CT和组织学检测其在非炎性环境下的体内成骨性能;体外分别通过LPS和IL-4诱导小鼠巨噬细胞系RAW264.7极化,通过定量实时聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 Ml 极化因子(iNOS、TNF-α、IL-1β)和M2极化因子(TGF-β、Arg-1、IL-10)的表达水平,分析CA+PGRN对巨噬细胞极化状态的影响;将CA水凝胶负载PGRN植入炎性牙周骨缺损模型中,术后2w和4w处死大鼠,取牙周骨缺损部位的组织,进行HE染色、MASSON染色、免疫组化等检测,分析炎性环境中牙周骨缺损处的骨修复情况;通过qRT-PCR、流式细胞术检测牙龈组织中巨噬细胞和CD4+T细胞极化相关因子的基因表达水平及颌下淋巴结中Th17、Treg细胞所占比例,分析其对炎性牙周骨缺损微环境的免疫调节作用。实验结果:1.羧甲基壳聚糖/甲壳素促进牙周膜干细胞的增殖和成骨分化将CMCTS或CMCT与hPDLSCs共培养,细胞增殖能力检测结果表明低剂量(100 μg/mL)的CMCTS和CMCT均能明显促进hPDLSCs的增殖及克隆形成能力;用含CMCTS或CMCT的成骨诱导条件培养基培养hPDLSCs,在21 d时茜素红染色(alizarine red staining,ARS)矿物质沉积结果表明添加CMCTS组的矿物质合成能力高于CMCT组;进一步分析成骨诱导因子,发现在7-21 d的成骨诱导过程中,CMCTS联合成骨诱导条件培养基可以促进hPDLSCs成骨分化,其成骨细胞分化标志物ALP、Runx2、OPN、OCN的基因表达水平均表现出不同程度的升高,ALP、OPN的蛋白水平变化与基因表达结果一致;而CMCT主要以诱导ALP的表达升高为主。2.可注射性原位动态水凝胶CA的表征及促成骨活性采用高碘酸钠在乙醇-水混合相中氧化法制备HAD,工艺简单,操作方便。通过红外光谱及斐林试剂反应均证明所制备的HAD中有醛基的存在;HAD与CMCTS通过席夫碱反应触发凝胶化,红外光谱证明了亚胺键的形成;通过成胶性、吸水率、溶胀度、流动性以及自愈合能力的表征,发现水凝胶从双联注射器中推出时,能够快速形成水凝胶,但不同交联度水凝胶的成胶时间、黏稠度、多孔结构、自愈合能力及细胞毒性等性能不同。据此筛选出最佳交联度的CMCTS-HAD水凝胶CA。体内降解性实验发现材料植入大鼠皮下和肌肉没有引selleck产品起明显的纤维化包膜,且HE染色发现10 d后炎症逐步消退,20 d材料基本降解、炎症消退,表明CA具有良好的组织相容性。体外成骨实验结果表明在成骨诱导培养液中添加CA凝胶组份后能够明显促进PDLSCs成骨相关因子ALP、OPN以及Collagen Ⅰ的表达,亦能促进矿selleckchem物质沉积。3.CA负载PGRN促炎性牙周骨缺损再生及免疫调节中度交联的CA水凝胶及冻干膜对PGRN有很好的缓释作用,能够释放出活性PGRN因子;体外成骨实验发现CA及其联合PGRN能促进PDLSCs的矿化,显著促进ALP、OPN以及Runx2的蛋白表达;大鼠颅骨缺损模型显示,CA+PGRN组中Micro-CT显示的新生骨体积分数(BV/TV)和组织学上的新生骨所占缺损的比例均显著高于对照组和CA组;体外通过对巨噬细胞M1/M2型极化相关因子的基因表达水平检测,发现CA负载PGRN能够显著抑制LPS诱导的M1型极化相关基因iNOS、IL-1β、TNF-α的表达,显著上调IL-4诱导的M2型极化相关基因IL-10、TGF-β的表达;CA也具有抑制M1极化的作用,但对促进M2极化作用不明显。将负载PGRN的CA水凝胶注入大鼠炎性牙周骨缺损区并定期观察修复作用,组织学结果表明CA组表现出促成骨作用趋势,而CA+PGRN组新生骨小梁更加明显,组织学上的新生骨所占缺损的比例均显著高于对照组和CA组;牙龈组织qRT-PCR检测表明,与对照组相比较,CA+PGRN组中,M1巨噬细胞相关因子iNOS、IL-1β、TNF-α的表达显著下调,而M2巨噬细胞和Treg细胞相关因子IL-10的表达显著上调;CA亦有抑制M1相关因子表达的趋势。通过流式细胞术检测颌下淋巴结内Th17和Treg细胞比例,与对照组比较,CA和CA+PGRN组中的Th17比例显著降低,Treg 比例有增加的趋势,Th17/Treg 比值显著降低;CA+PGRN组的Th17比例和Th17/Treg 比值显著低于CA组。结论:1.CMCTS和CMCT均具有体外促hPDLSCs成骨分化的作用,CMCTS的促成骨活性更强。2.通过水-醇相氧化HA反应成功制备醛基化HAD,使其能够与CMCTS分子上的氨基发生席夫碱反应形成亚胺键,交联得到可注射性复合水凝胶CA;中度交联的CA凝胶具有成胶快、粘度高、吸水性强、溶胀率适中、多孔结构均一、快速自愈合等性能;且具有良好的生物相容性、可降解性以及体外促hPDLSCs成骨分化和体内外的免疫调节作用。3.CA负载PGRN水凝胶能够缓释PGRN因子并保持其良好的生物活性,实现牙周炎免疫微环境的调节并促进骨缺损再生。本研究为PGRN用于基于原位牙周组织工程原理的牙周再生治疗提供了潜在的可行性方案,亦为其他生长趋化因子或药物的相关研究提供了潜在的新思路。