玉米作为世界三大粮食作物之一,也是世界上种植最广泛的作物之一。但其生产受到干旱胁迫的严重威胁,不断选育更抗旱的新品种是解决该问题的有效途径之一。目前,转基因等新兴生物技术的迅速发展极大地提高了育种效率,挖掘玉米抗旱基因并研究其作用机制,利用转基因技术进行作物改良,对于玉米抗旱新品种的培育具有重要意义。NAC转录因子在植物中广泛存在且在植物干旱胁迫响应中发挥着关键作用。在本研究中,我们发现一个与逆境胁迫相关的NAC基因ZmNAC20,通过生物信息学分析,对ZmNAC20进行启动子元件分析预测其表达可能与脱落酸(ABA)和干旱胁迫有关。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)发现ZmNAC20受ABA和干旱胁迫诱导上调表达。为检测ZmNAC20是否参与干旱胁迫响应,我们构建了ZmNAC20过表达载体,通过遗传转化技术,将该载体转入玉米自交系B104,获得过表达玉米植株(ZmNAC20-OE)。通过干旱胁迫处理,发现ZmNAC20armed conflict过表达增强玉米抗旱性。具体研究结果如下:(1)ZmNAC20受ABA和干旱胁迫诱导上调表达。对生长12天的玉米幼苗进行脱水胁迫处理后,q RT-PCR分析结果显示在玉米叶片中ZmNAC20的表达显著上调,说明干旱胁迫促进了ZmNAC20的表达。用不同浓度的ABA处理玉米叶片1 h,结果显示ABA处理提高了ZmNAC20的表达量。用1μM ABA处理不同时间也可以促使ZmNAC20上调表达。这些结果表明,干旱胁迫和ABA共同调控了ZmNAC20的表达。另外,用PEG和盐胁迫处理玉米植株同样能诱导ZmNAC20上调表达。利用激光共聚焦显微镜技术发现ZmNAC20定位于细胞核中。同时ZmNAC20基因的启动子元件分析预测显示其上游启动子区含有与干旱及ABA响应相关的顺式作用元件。(2)ZmNAC20过表达增强玉米抗旱性。为探究玉米ZmNAC20基因在干旱胁迫应答中的功能,将ZmNAC20过表达载体遗传转化到玉米自交系B104,获得了ZmNAC20过表达的转基因玉米植株ZmNAC20-OE。在干旱胁迫14天后,发现ZmNAC20-OE玉米叶片略黄且卷曲,对照B104玉米叶片则开始萎蔫甚至死亡;复水3天后,ZmNAC20-OE玉米叶片逐渐变绿,成活率达80%左右,远高于B104,说明ZmNAC20-OE玉米植株具有明显的抗旱性。在干旱胁迫12天,ZmNAC20-OE玉米植株体内超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性以及清除活性氧的能力显著高于B104,说明干旱胁迫下ZmNAC20过表达能影响玉米植株体内的抗氧化酶体系,清除活性氧的积累量,从而影响植株的耐旱性。干旱胁迫下ZmNAC20-OE玉米具有更高的叶片相对含水量,表明ZmNAC20-OE玉米植株在干旱胁迫下能够较长时间维持细胞的正常生长状态,在提高抗旱性方面具有积极作用。此外干旱胁迫下ZmNAC20-OE玉米叶片具有更强的光合效率和生物量积累。这些结果表明ZmNAC20能够降低干旱胁迫对玉米带来的伤害,提高玉米抵御干旱胁迫的能力SBE-β-CD。(3)ZmNAC20过表达促进ABA介导的气孔关闭。为探究玉米叶片气孔与ZmNAC20基因抗旱性的关系,本研究观察B104和ZmNAC20-OE玉米在干旱胁迫下的气孔运动变化情况,发现经脱水胁迫处理200 min后,B104的玉米叶片严重卷曲,而ZmNAC20-OE玉米叶片表现出轻微的卷曲表型,ZmNAC20-OE玉米叶片的水分损失率低于B104,这些结果表明ZmNAC20-OE玉米叶片具有更强的抗脱水能力,ZmNAC20过表达可以促使玉米叶片保持更多的水分,增强抗旱性。气孔观察实验结果显示脱水胁迫下,ZmNAC20-OE玉米叶片气孔关闭速度显著比B104更迅速,具有更少的水分散失。ABA处理下ZmNAC20-OE玉米气孔关闭速度比B104快,ZmNAC20-OE植株气孔关闭对ABA的敏感性高于B104。这些结果表明,ZmNAC20促进玉米气孔关闭,减少水分流失,从而增强玉米的抗旱性。此外,干旱胁迫下ZmNAC20还能诱导ZmNCED3等ABA生物合成基因以及Zm SLAC1等气孔发育相关基因的表达。(4)ZmNAC20激活多个胁迫响应基因表达。利用RNA-Seq分析发现AY-22989半抑制浓度脱水胁迫处理后ZmNAC20过表达植株中上调表达的基因主要在非生物刺激、光合作用、激素、寒冷、缺水、盐胁迫和渗透胁迫等途径富集,干旱胁迫和ABA处理下ZmNAC20显著促进Zm DHN2、Zm GA2OX6和Zm SWEET17A等胁迫响应基因的上调表达。这些结果表明ZmNAC20调控了干旱胁迫响应中各种基因的表达,ZmNAC20通过多种基因调控网络,提高抗旱性。(5)ZmNAC20参与调控多种信号转导途径。利用DAP-seq技术,发现ZmNAC20直接结合1304个靶基因。对ZmNAC20直接结合的序列进行分析,发现结合片段主要集中在转录起始位点附近。由于转录因子可通过识别特定的DNA序列来调节转录,对ZmNAC20结合片段中显著的元件序列分析显示,发现3个非常显著的核心结合元件。通过KEGG分析,发现ZmNAC20主要参与调控RNA转运、激素信号转导、MAPK激酶信号转导等途径。在干旱胁迫下,通过DAP-seq和RNA-seq关联分析,发现65个ZmNAC20直接调控的靶基因,其中上调表达43个,下调表达22个。综合以上结果分析,本研究鉴定了转录因子ZmNAC20在玉米中具有抗旱功能。通过促进玉米气孔关闭和激活应激基因的表达来提高玉米的抗旱性,并揭示了植物适应水分亏缺胁迫的分子机制。同时,为玉米响应干旱胁迫机制提供了一个有价值的基因和新的线索,对玉米抗旱遗传改良和分子育种具有重要意义。