目的:通过结膜吸吮线虫巨噬细胞迁移抑制因子(T.cp-MIF)重组蛋白诱导THP-1源巨噬细胞,明确巨噬细胞由M1型动态转变为M2极化亚型;进而基于差异转录组数据筛选巨噬细胞动态极化中的转录因子及其调控的下游靶基因,最后探讨筛选出的关键转录因子CCAAT/增强子结合蛋白β(CCAAT/enhancer binding protein beta,Csilent HBV infection/EBPβ),对T.cp-MIF诱导巨噬细胞M2b型极化的影响,为深入了解结膜吸吮线虫迁移抑制因子与宿主的免疫互作机制打下基础。方法:1.T.cp-MIF对THP-1源巨噬细胞M2极化亚型的影响(1)分组:实验组分别用T.cp-MIF(50 ng/m L)诱导THP-1源巨噬细胞24 h和48 h,设不加T.cp-MIF的对照组;(2)巨噬细胞极化表型分子检测:流式细胞术(Flow cytometry,FCM)测定各组巨噬细胞表型分子CD11b、CD14、CD86、CD206、CD80和CD163的变化;(3)巨噬细胞极化相关细胞因子检测:实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-q PCR)检测各组细胞IL-10、IL-4、IL-6和TGF-β的m RNA相对表达量变化;蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)检测各组细胞IL-10、IL-4、IL-6和TGF-β的蛋白表达量变化。2.影响T.cp-MIF诱导巨噬细胞M2b型极化的转录因子及其靶基因筛选:基于差异转录组数据分析,初步筛选与巨噬细胞极化相关TLRs信号通路的转录因子;通过CISTROME、h TFtarge和TRRUST三个转录因子数据库分析,进一步筛选并获得目标转录因子,并根据结合位点预测目的转录因子调控巨噬细胞极化信号通路的下游靶基因,用DAVID数据库进行GO功能富集显著性分析和KEGG pathway显著性分析。3.转录因子C/EBPβ参与调控T.cp-MIF诱导巨噬细胞M2b型极化的作用研究:(1)T.cp-MIF诱导巨噬细胞24 h和48 h,RT-q PCR检测C/EBPβ、CRwww.selleck.cn/products/cb-839EB、CXCL8和SESN2的m RNA相对表达量变化;WB检测各组C/EBPβ、CREB、CXCL8和SESN2蛋白及其SAHA磷酸化的表达量变化,观察T.cp-MIF作用巨噬细胞后对C/EBPβ及其调控靶基因的影响。(2)Withaferin A(C/EBPβ抑制剂)对T.cp-MIF诱导巨噬细胞M2b型极化的影响:设对照组、DMSO组(有机溶剂组)、Withaferin A组、T.cp-MIF组和T.cp-MIF+Withaferin A组,分别作用24 h和48 h,RT-q PCR检测各组细胞CREB、SESN2和CXCL8的m RNA相对表达量变化;WB检测各组细胞CREB、SESN2和CXCL8蛋白及蛋白磷酸化表达量变化;RT-q PCR检测各组细胞IL-6的m RNA相对表达量变化,WB检测各组细胞IL-6的蛋白表达量变化。结果:1.T.cp-MIF对巨噬细胞M2极化亚型的影响:实验24 h组的M1型巨噬细胞(CD11b和CD86双阳细胞)占93.6%,IL-6的m RNA相对表达量和蛋白表达量均显著增加(P<0.05);实验48 h组巨噬细胞表型分子CD11b、CD206以及CD11b、CD80的双阳细胞分别占91.5%和92.7%,为M2b型极化;与实验24 h组比较,实验48 h组的M2b型巨噬细胞相关细胞因子IL-10的m RNA相对表达量和蛋白表达量均显著增加(P<0.05);IL-6的m RNA相对表达量和蛋白表达量均显著降低(P<0.05);M2a型巨噬细胞相关细胞因子IL-4的m RNA相对表达量及蛋白表达量无显著变化(P>0.05);M2c型巨噬细胞相关细胞因子TGF-β的m RNA相对表达量及蛋白表达量无显著变化(P>0.05)。2.转录因子及其调控靶基因的筛选:(1)基于差异转录组数据分析,筛选出T.cp-MIF诱导后与M2b型巨噬细胞极化相关的TLR信号通路的转录因子C/EBPβ、CREB和CEBPG(P<0.01)。(2)公共数据库筛选C/EBPβ调控靶基因结果显示:实验24 h组和对照组相比差异倍数最大的靶基因为CXCL8(P<0.05),实验48h组和实验24 h组相比差异倍数最大的靶基因为SESN2(P<0.01)。(3)GO功能富集显著性分析结果显示C/EBPβ相关靶基因主要与c AMP依赖的蛋白激酶活化和免疫反应相关;KEGG pathway显著性分析结果显示m TOR和TLRs信号通路显著上调。3.转录因子C/EBPβ及其调控靶基因参与T.cp-MIF诱导巨噬细胞M2b型的作用研究:(1)与对照24 h组相比,T.cp-MIF诱导24 h后C/EBPβ和CREB的m RNA相对表达量和蛋白磷酸化表达量无显著差异(P>0.05),与实验24 h组相比,实验48 h组C/EBPβ和CREB的m RNA相对表达量和蛋白磷酸化表达量均显著增加(P<0.05);与对照24 h组相比,T.cp-MIF诱导24 h后CXCL8的m RNA相对表达量和蛋白表达量增加(P<0.05),与实验24 h组相比,实验48 h组CXCL8的m RNA相对表达量和蛋白表达量显著降低(P<0.05);与对照24 h组比较,实验24 h组SESN2的m RNA相对表达量和蛋白表达量显著降低(P<0.01),与实验24 h组比较,实验48 h组SESN2的m RNA相对表达量和蛋白表达量显著增加(P<0.05)。(2)C/EBPβ抑制剂Withaferin A作用后,与T.cp-MIF 48 h组相比,T.cp-MIF+Withaferin A组在作用后48 h的CREB和SESN2的m RNA相对表达量和蛋白表达量显著降低(P<0.05);与T.cp-MIF 48 h组相比,T.cp-MIF+Withaferin A 48 h组IL-6的m RNA相对表达量和蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论:T.cp-MIF可诱导THP-1源巨噬细胞由M1型向M2b型转变的动态极化;其作用机制与T.cp-MIF诱导后TLRs信号通路的关键转录因子C/EBPβ激活有关,通过促进下游靶基因SESN2表达增高,调控巨噬细胞的M2b型极化。