昆虫是地球上种类最多、分布最广的动物群体,它生活在复杂多变的环境中,并通过先天免疫来应对细菌、真菌、病毒等外源病原物的入侵。昆虫的先天免疫包括细胞免疫和体液免疫。有研究表明,JAK/STAT信号通路可以通过上调免疫效应分子的表达来参与昆虫的体液免疫。JAK/STAT信号通路是主要的细胞内信号转导途径之一,该通路参与了许多重要的生物学过程,包括细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等。在哺乳动物中,该通路活性的丧失会导致其对细菌的易感性增加。JAK/STAT信号通路已被证明可以通过调控抗菌肽基因的表达来参与甲壳类动物的抗菌免疫反应。在昆虫中,JAK/STAT信号通路也已被证明参与果蝇、冈比亚按蚊、棉铃虫以及豌豆蚜等对抗细菌感染的免疫应答。家蚕(Bombyx mori)是重要的经济昆虫,但它在大规模饲养的过程中容易受到细菌、真菌等病原带来的疾病威胁,从而给蚕业造成严重的经济损失。已有研究发现,大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白僵菌感染能激活家蚕JAK/STAT信号通路,但是该通路下游关键转录因子Bm STAT是否参与以及如何参与家蚕的抗菌免疫反应还有待Immun thrombocytopenia进一步探索。本研究首先探究了家蚕JAK/STAT信号通路关键基因在不同免疫组织中对细菌、真菌感染的响应,然后从细胞水平和个体水平探究转录因子Bm STAT在抗菌免疫反应中的功能。主要研究结果如下:1.家蚕JAK/STAT信号通路对细菌、真菌的免疫应答家蚕中Bm STAT具有两种剪切形式:Bm STAT-S和Bm STAT-L。向5龄3天家蚕注射大肠杆菌(G-)、金黄色葡萄球菌(G+)和酿酒酵母(真菌)后3、6、12、24 h,利用q RT-PCR检测JAK/STAT信号通路关键基因在脂肪体、血细胞和中肠中的表达。结果显示,在细菌、真菌感染后,Bm DOME、Bm HOP、Bm STAT-S和Bm STAT-L在这三个组织中的表达均明显上调,说明家蚕JAK/STAT信号通路可以响应细菌、真菌刺激后的免疫反应过程,该信号通路可能参与了家蚕的抗菌免疫反应。2.Bm STAT参与调控家蚕细胞中抗菌肽的表达家蚕胚胎细胞系(Bm E)在脂多糖(LPS)与肽聚糖(PGN)刺激后,在0、6、12、24 h检测Bm STAT-S和Bm STAT-L基因的转录水平变化,结果显示,Bm STAT-S和Bm STAT-L基因的表达量从6 h开始均明显升高,说明Bm STAT基因对LPS与PGN的刺激有响应。亚细胞定位分析显示,在Bm E细胞中,正常情况下过表达的Bm STAT-S和Bm STAT-L主要定位于细胞质;在LPS与PGN刺激后,细胞核中Bm STAT-SPR-171说明书和Bm STAT-L的含量明显增加,说明LPS与PGN刺激会促进Bm STAT-S和Bm STAT-L由细胞质向细胞核易位,从而激活Bm STAT转录因子调控下游靶基因的表达。为了进一步探究Bm STAT对抗菌肽基因表达的影响,我们分别在细胞中过表达和干涉了Bm STAT基因。结果显示,细胞中过表达Bm STAT-S与Bm STAT-L后,抗菌肽基因Gloverin 1、Gloverin 3、Gloverin 4、Moricin、Cecropin A、Cecropin B和Lebcoin的表达量均显著升高。相反,细胞中干涉Bm STAT后,这些抗菌肽基因的表达量均显著降低。表明转录因子Bm STAT可以直接或间接调控抗菌肽基因的表达。3.Bm STAT参与调控家蚕抗菌肽的表达利用转基因技术构建过表达Bm STAT家蚕:OE-Bm STAT-S家蚕和OE-Bm STAT-L家蚕。发现OE-Bm STAT-S家蚕和OE-Bm STAT-L家蚕脂肪体中抗菌肽基因Gloverin 1、Gloverin 3、Gloverin 4、Moricin、Cecropin A、Cecropin B和Lebcoin的表达量均显著提高。相反,在本小组前期构建的Bm STAT全身性转基因干涉家蚕A4-ds Bm STAT的脂肪体中,这些抗菌肽基因的表达量均显著降低。这进一步证明了家蚕转录因子Bm STAT能够调控抗菌肽基因的表达。将获得的转基因家蚕进行细菌、真菌的攻毒实验。发现在金黄色葡萄球菌感染后,相比于对照组,OE-Bm ST点击此处AT-S家蚕存活率提高了83%;而OE-Bm STAT-L家蚕存活率无差异,但其死亡速度较慢;相反,A4-ds Bm STAT家蚕的死亡速度明显加快。在白僵菌感染后,相比于对照组,OE-Bm STAT-S家蚕的存活率提高了47%,OE-Bm STAT-L家蚕的存活率提高了20%,相反,A4-ds Bm STAT家蚕的存活率降低了17%。说明转录因子Bm STAT能够影响家蚕对金黄色葡萄球菌和白僵菌的抗性。综上所述,发现家蚕JAK/STAT信号通路可以在细菌、真菌感染后被激活。在家蚕细胞和个体中过表达Bm STAT能促进抗菌肽基因的表达,增强家蚕对金黄色葡萄球菌和白僵菌的抗性。相反,干涉Bm STAT能抑制抗菌肽基因的表达,减弱家蚕对金黄色葡萄球菌和白僵菌的抗性。本研究不仅阐明了转录因子Bm STAT基因在家蚕免疫调节中的功能,同时获得了抗菌能力较强的家蚕素材。