近年来,大气污染引发的健康问题一直是全世界关注的焦点以及科学研究的热点。其中,超细颗粒物(PM_(0.1),空气动力学直径≤100 nm)可能是导致健康损伤的主要贡献者。现有研究提示了PM_(0.1)暴露与神经系统疾病的相关性。然而,颗粒物的摄入途径及其是否具有神经发育毒性效应尚不明确。小鼠胚胎干细胞(mESCs)具有发育全能性,可以定向诱导分化成神经元,被用于研究各种环境污染物的早期胚胎发育毒性和功能性毒性。为此,本课题拟基于胚胎干细胞阐明超细颗粒物的摄入行为及其对神经发育的影响及相关分子机制。1.考虑到大气环境及其污染物的复杂性,本部分研究选择量子点(QDs)作为模式超细颗粒物探究其在mESCs中的摄入及外排行为。首先,我们通过透射电子显微镜(TEM)、动态光散射、荧光分光光度计和电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对QDs的形貌、zeta电位、水合粒径、光谱特征及稳定性进行了表征,发现QDs是粒径约为10 nm的球形颗粒,其在水和培养基中均带负电,其最佳发射波长为646 nm,并且在水溶液中不易释放金属离子;通过细胞活力筛查了QDs的亚致死浓度,在此基础上,借助QDs的荧光信号,结合流式细胞仪及荧光成像研究了QDs在mESCs中的摄入、外排过程。结果表明,mESCs对QDs的摄取具有时间和剂量依赖效应,同时QDs会被细胞外排,部分被细胞摄取的QDs存在于细胞内。2.大脑发育是一个复杂且精密调控的过程,定向诱导mESCs神经分化为神经发育领域研究提供了有力依据。为此,本部分研究拟建立mESCs单层神经分化模型探究PM_(0.1)潜在的神经发育毒性。我们首先对PM_(0.1)的形貌、zeta电位及水合粒径进行了表征,发现其为不规则聚集体,它的水合粒径大于TEM粒径,且在水和培养基中均带负电;在亚致死浓度暴露的基础上,发现PM_(0.1)暴露产生氧化应激并影响mESCs自我更新能力;将mESCs定向诱导神经分化后,通过光学显微镜、RT-q PCR技术及Fluo-3 AM荧光探针,考察PM_(0.1)对神经细胞形Immuno-chromatographic test态学、多能性、神经发生关键因子、细胞内Ca~(2+)水平及细胞周期等神经发育的影响。结果表明,PM_(0.1)暴露会影响神CB-839说明书经丝的数量、改变神经元形态,诱导神经发生相关因子Map2、Dcx、Neurod1、Pax6、Snai2、Msx2的表达降低和多能性因子Sox2的表达增加,从而抑制mESCs神经分化。同时,PM_(0.1)暴露增加了细胞内钙离子水平、抑制了细胞增殖,使细胞G1期和S期进程受阻。3.现有研究表明,RNA甲基化在神经发生以及神经发育过程中发挥重要的调控作用。在本部分研究中,我们基于甲基化RNA免疫共沉淀结合高通量测序(MeRIP-seq)探究了PM_(0.1)介导神经分化异INCB018424临床试验常的分子机制。首先,通过RT-q PCR实验检测了PM_(0.1)暴露后N~6-甲基腺嘌呤(m~6A)修饰的甲基化转移酶、去甲基化酶和识别蛋白的m RNA表达量,发现PM_(0.1)诱导甲基转移酶(Mettl3、Mettl14、Wtap)表达升高、去甲基化酶(Fto)表达降低及识别蛋白(Ythdc1、Ythdc2、Ythdf2、Hnrnpa2b1、Eif3a)表达异常。功能富集分析(GO分析)发现发生差异m~6A甲基化修饰的m RNA主要富集在突触组织、轴突生成、树突发育、神经发生调节、前脑发育等神经发育过程。进一步对其进行MeRIP-seq和RNA-seq联合分析,发现PM_(0.1)处理组中的92个m RNA的表达变化可能与m~6A修饰有关。通过Clue GO对这些差异基因进行GO富集分析,发现变化最为明显的团簇为大脑发育过程,经过验证发现PM_(0.1)暴露后可能通过m~6A修饰降低Sall1、Pou4f1、Bcl11b、Zic1、Hoxa2、Nr2e1表达进而影响神经发育过程。综上所述,本研究考察了超细颗粒在mESCs中的摄入、外排行为,通过体外诱导神经分化模型,进一步解析了PM_(0.1)的潜在神经发育毒性机制,实验数据为PM_(0.1)的健康风险评估提供了理论依据。