荧光技术具有特异性好、灵敏度高、操作简便等优点,已被广泛应用于药物开发、疾病诊断及生物遗传分析等多个领域。例如,荧光技术在测量生物分子的动态相互作用中具有高灵敏度和高时空分辨率。除了生物分子的定量检测外,荧光技术还可用于测量细胞或组织的生理状态。本论文中,我们构建了基于单分子荧光检测技术和荧光光谱检测技术的两种生物传感器,分别用于超灵敏检测组蛋白乙酰化修饰酶p300和多聚(ADP-核糖)聚合酶-1。具体研究内容如下:1、我们发展了基于荧光标记抗体的单分子检测方法,实现了组蛋白乙酰化修饰酶p300的乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和巴豆酰转移酶(histone crotonyltransferase,HCT)活性的同时检测。组蛋白乙酰化修饰酶p300同时具有HAT和HCT的活性,可以催化组蛋白乙酰化/巴豆酰化,与基因表达以及一些疾病的发生有着紧密的联系。但目前开发的生物传感器侧重于检测HAT活性,对HAT和HCT活性的同时检测还缺乏可靠高效的方法。在本工作中,由于p300具有双酶活性的特征,我们以p300作为模型酶。我们合成N端生物素化的多肽序列作为p300的底物。当p300和乙酰供体乙酰辅酶A(acetyl-coenzyme A,Ac Co A)/巴豆酰辅酶A(crotonyl-coenzyme A,Cr Co A)存在的情况下,催化肽底物在相应赖氨酸残基上乙酰化/巴豆酰化。随后通过链霉亲和素-生物素的相互作用,乙酰化/巴豆酰化多肽可以与链霉亲和素包被的磁珠(magnetic beads,MBs)结合。通过抗体-抗原的特异性相互作用,Dy Light 488和Dy LightABT-263体外 650分别标记的抗组蛋白H3K18乙酰化抗体和抗组蛋白H3K18巴豆酰化抗体与乙酰化/巴豆酰化的多肽磁珠复合物结合,将两种酶活性信号转化为两种不同的荧光信号。随后染料标记的肽底物从游离荧光抗体中磁分离,并用去离子水洗脱,释放的荧光分子可以简单地通过单分子成像计数。通过测量Dy Light 488和Dy Light 650的荧光信号,可以同时定量检测p300的HAT和HCT活性。本方法特异性好,灵敏度高,对HAT检测限为1.75×10~(-4) n M,对HCT检测限为6.56×10~(-5) n M。此外,本方法可以准确地评价p300的HAT和HCT活性的动力学参数,并筛选抑制剂。同时本方法在临床诊断和药物发现研究中具有极大潜力。2、我们通过基于超支化扩增的荧光方法检测多聚(ADP-核糖)聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)的活性。PARP-1可以催化多聚(ADP-核糖)(poly(ADP-ribose),PAR)聚合物的形成,它广泛参与DNA修复和复制过程,对维持基因完整性至关重要。准确、灵敏地检测PARP-1对于临床诊断至关重要。然而,目前基于静电相互作用的PAPR-1检测通常操作复杂、灵敏度低且存在假阳性。在本工作中,我们利用生物素化-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(biotin-nicotinamide adenine dinucleotide,biotin-NAD~+)和末端脱氧核苷酸转移酶(termingermline genetic variantsal deoxynucleotidyl transferase,Td T)的独特特性,通过荧光方法证明了Td T激活的无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1(apurinic/apyrimidinic endonuclease 1,APE1)介导的超支化扩增可以用于PARP-1的活性检测。特异性双链DNA(double-stranded DNA,ds DNA)激活的PARP-1催化NAD~+或biotin-NAD~+的多个ADP-核糖转移到PARP-1自身PEG300纯度,形成含有生物素的ds DNA-PARP-1-PAR聚合物的生物偶联物。随后,形成的生物偶联物被MBs捕获。捕获的ds DNA具有双3′-OH末端可通过超支化扩增,产生明显的荧光信号。本方法具有无标记、无模板、无静电相互作用、高灵敏度和高准确性检测PARP-1的优点。此外,本方法将PARP-1酶信号转化为可放大的DNA信号,而无需费力地制备和功能化纳米材料,大大缩短了检测时间。本方法可灵敏、快速地检测PARP-1,检测限为4.37×10~(-8)U/μL,可应用于单个细胞的PARP-1的活性检测。同时,本方法能够筛选PARP-1抑制剂,并准确区分健康人和肺癌患者的肺组织中PARP-1的表达水平,在药物研发和临床诊断中具有巨大的潜力。