研究背景:人内源性逆转录病毒(Human Endogenous Retroviruses,HERVs)是古老的外源性逆转录病毒感染人类祖先的残余,逐渐发展进化并整合到人基因组中,按照Genetic animal models孟德尔定律遗传给后代,约占人类基因组的8～9%。HERVs的结构包含四个编码区(gag、pro、pol、env)以及连接在3’和5’端的长末端重复序列(Long terminal repeat,LTR)。HERVs具有多种生理功能,在胚胎发育、基因转录与表达等方面均发挥重要作用。随着数百万年时间的流逝,由于移码、突变,亦或是序列缺失等原因,大多数整合的HERVs失去了编码能力,保持沉默。但仍有一些HERVs基因具有完整的开放阅读框(open reading frame,ORF),能够编码具有生物学活性的蛋白或完整的前病毒。其中HERV-K在HERVs家族中整合最晚,生物活性最强。在健康人的正常细胞中,HERV-K通常处于沉默状态,转录水平极低,但在肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等恶性肿瘤或其他病理状态下常有HERV-K m RNA或蛋白的异常转录与表达,在白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤患者中也观察到这一现象。然而,目前对于血液系统恶性肿瘤HERV-K转录特征的研究仅有零散的报道,病例数通常较少且结论不一致;一般仅检测HERV-K某个编码区的转录水平,没有对HERV-K各编码区的转录水平以及其整合位点的功能进行系统探索,无法全面概括血液系统恶性肿瘤HERV-K异常转录的特点并分析HERV-K异常转录对于血液恶性肿瘤发生发展的作用。研究目的:以白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤患者为研究对象,检测患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)以及不同细胞亚群的HERV-K转录水平,分析HERV-K异常转录对细胞功能可能的影响。进一步检测和分析具有转录活性的HERV-K整合位点及转录水平的差异,初步探索转录水平升高的HERV-K整合位点的生物学作用。最终对数据进行综合分析,以全面了解血液恶性肿瘤HERV-K异常转录的特征,分析其与肿瘤发生发展的关系,为深入认识血液系统恶性肿瘤的发病机制、制定新型诊治策略提供依据。研究方法:(1)招募白血病、淋巴瘤、骨髓瘤和骨髓增生异常综合征患者和健康对照人群,收集外周血样本及背景信息,通过实时定量PCR方法检测PBMC中HERV-K gag、pol、env转录水平,分析不同人群HERV-K转录水平的差异,同时分析HERV-K转录水平与患者病理类型或临床分期的相关性。进一步检测PBMC中不同细胞亚群HERV-K转录和细胞因子表达水平。(2)分析白血病和淋巴瘤患者具有转录活性的HERV-K整合位点,采用二代测序方法对各HERV-K整合位点测序,使用Hisat2、Samtools、Feat更多ure Counts、Deseq2等生信分析工具对HERV-K整合位点的转录水平进行差异性分析,筛选出患者体内转录水平发生显著改变的HERV-K整合位点和序列,进一步通过GO分析和KEGG富集,分析整合位点的生物学作用。(3)对筛选出的由21q21.1位点编码的长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA),MIR548XHG的功能进行初步鉴定和分析。以白血病细胞系KASUMI-1为模型,分别转染靶向结合MIR548XHG m RNA的小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA)和MIR548XHG过表达质粒,探索MIR548XHG与其下游mi RNA-548X的调控关系,以及MIR548XHG、mi RNA-548X的不同转录和表达水平对细胞增殖的影响。研究结果:(1)共招募符合诊断标准的352例淋巴瘤、263例白血病、20例骨髓瘤、14例骨髓增生异常综合征患者,以及64例健康对照。各类患者外周血PBMC中HERV-K gag、pol、env转录水平均显著高于健康对照(P<0.0001)。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者HERV-K转录水平高于急性淋巴细胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL),在AML患者中,存在临床分期预后越差HERV-K转录水平越高的趋势。在白血病和淋巴瘤患者PBMC的不同细胞亚群中,仅有B淋巴细胞的HERV-K转录水平升高(P<0.01),同时伴随着B淋巴细胞相关细胞因子表达水平的降低(P<0.01)。而T淋巴细胞和中性粒细胞的HERV-K转录水平无明显变化(P>0.05),相关细胞因子表达水平也无明显变化(P>0.05)。(2)确定白血病与淋巴瘤患者体内具有转录活性的HERV-K整合位点共计82个,其中HERV-K gag、pol、env的整合位点分别为23个、25个和34个。与健康对照相比,白血病患者共有23个HERV-K整合位点转录水平发生改变,其中20个位点转录水平升高,3个位点转录水平下降;淋巴瘤患者共有20个HERV-K整合位点转录水平发生改变,其中12个位点转录水平升高,8个位点转录水平下降。转录水平升高的位点可以编码ERVK-28等Lnc RNA、天冬氨酸和异天冬氨酸肽酶等;转录水平降低的位点可以编码防御素、Lnc RNA 2614等,部分转录水平发生改变的HERV-K整合位点在人类基因组中尚无注释。筛选出3条分别在白血病和淋巴瘤患者中表达水平升高的HERV-K序列。GO分析和KEGG富集分析表明HERV-K在白血病和淋巴瘤患者体内参与多种生物学功能,包括白介素4分泌的调控,免疫应答的负向调节,适应性免疫的负向调节等。(3)在白血病患者中,HERV-K整合位点21q21.1编码Lnc RNA,MIR548XHG。转染抑制MIR548XHG转录的si RNA后,MIR548XHG转录和mi RNA-548X表达水平均下降,且白血病细胞系KASUMI-1的增殖能力也下降(P<0.05)。转染MIR548XHG过表达质粒后,MIR548XHG转录和mi RNA-548X表达均升高,KASUMI-1细胞的增殖能力也升高(P<0.05)。研究结论:(1)各类血液系统恶性肿瘤患者的PBMC普遍存在HERV-K gag、pol、env转录水平的提高,并且HERV-K转录水平与疾病的临床进展、预后有一定关系。白血病和淋巴瘤患者PBMC中HERV-K转录水平的升高源于B淋巴细胞,伴随B淋巴细胞相关细胞因子表达水平的降低和功能的改变。(2)确定了白血病与淋巴瘤患者体内具有转录活性的HERV-K整合位点。虽然这两类患者外周血PBMC中HERV-K转录水平显著升高,但不是全部HERV-K整合位点的转录水平均升高,有部分HERV-K位点的转录水平下降。白血病和淋巴瘤患者外周血中转录水平发生改变的HERV-K整合位点,可能负向调节宿主的免疫应答进而抑制宿主的免疫功能。(3)确定了3条在白FG-4592配制血病和淋巴瘤患者体内特异性表达的HERV-K序列,有望成为基于HERV-K的白血病和淋巴瘤诊断标记物。(4)转录水平升高的HERV-K整合位点编码的Lnc RNA,MIR548XHG,能够正向调控其下游mi RNA-548X表达,进而影响白血病细胞的增殖。