木质纤维素是地球上最为丰富的生物质资源。能够降解木质纤维素的纤维素酶和半纤维素酶在食品、饲料、纺织行业已获得广泛应用,在精细化学品和替代能源的生产方面也展现了巨大的应用潜力。以里氏木霉(Trichode)rma reesei、草酸青霉(Penicillium oxalicum)、黑曲霉(Aspergillus niger)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)等为代表的丝状真菌能够高效合Rapamycin使用方法成并分泌纤维素酶,是工业生产中纤维素酶的主要来源。纤维素酶的合成主要在转录水平受控。多种序列特异性的转录因子(sequence-specific transcription factors)发挥了激活或抑制纤维素酶基因转录的效应。转录因子的稳定性、亚细胞定位、与DNA/蛋白质的亲和力受磷酸化、泛素化、乙酰化等多种翻译后修饰过程的影响;许多转录因子结合DNA后,还需招募辅因子(cofactors)以协同调控转录。因此,寻找、鉴定与转录因子具有相互作用的蛋白,确认其中是否含有执行翻译后修饰的酶/蛋白、是否含有辅因子,是探索转录因子调控基因表达机制的重要研究内容。对基因、序列特异的转录因子及其相互作用蛋白几种元素相互作用复杂模式的研究,对于深层次揭示真核生物的基因转录调控机制具有重要的理论意义。同时,发现的与转录因子具有相互作用的蛋白还可能成为对纤维素酶生产菌株进行分子改造的靶点。研究具有深刻的理论意义和重要的实践意义。本文以重要的产纤维素酶的丝状真菌草酸青霉为研究对象,对直接调控纤维素酶基因表达的转录因子Ace1、间接调控纤维素酶基因表达的转录因子CrzA调控基因转录的机制进行了研究。捕捉并鉴定了与转录因子Ace1具有直接相互作用的F-box蛋白Fbx23,对其生物学功能进行了研究,提出了 Ace1受含有F-box蛋白Fbx23的泛素连接酶SCF复合物(Skp1,Cullin,F-box complex)控制,调控纤维素酶基因表达的可能机制。捕捉了与转录因子CrzA具有相互作用的蛋白,绘制了草酸青霉钙调磷酸酶-转录因子CrzA通路。论文的主要研究内容及结果如下:1.草酸青霉转录因子PoAce1相互作用蛋白的捕捉和鉴定转录因子Ace1最初被认为是纤维素酶基因表达的转录激活因子,也因此被命名(activator of cellulase expression)。但后续的研究发现,Ace1实质是纤维素酶基因表达的转录抑制因子。里氏木霉和草酸青霉中Ace1的缺失能够提Dibutyryl-cAMP抑制剂高纤维素酶的合成。但Ace1调控基因表达的机制尚未获得解析。使用蛋白质串联亲和纯化(tandem affinity purification,TAP)联合质谱(TAP-MS)技术,以草酸青霉Ace1(PoAce1)为诱饵,捕获并鉴定了与PoAce1具有相互作用的蛋白。在捕获的8个蛋白中,泛素连接酶SCF复合物的两种组分Skp1和F-box蛋白Fbx23的丰度位于前两位。SCF复合物的另外两个组分Rbx1和Cul1也被发现。结果显示,转录因子PoAce1与Rbxl-Cul1-Skp1-Fbx23构成的泛素连接酶SCF复合物密切相关。酵母双杂交的结果进一步支持了 PoAce1与SCF复合物中的Fbx23具有直接的相互作用。双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)的结果证实 PoAce1-Fbx23 的相互作用发生在细胞核内。SCFFbx23复合物(上标表示泛素连接酶中负责识别底物的可变F-box亚基)中Fbx23亚基起到识别并结合转录因子PoAce1作为底物的功能。2.草酸青霉F-box蛋白PoFbx23的功能研究研究了草酸青霉Fbx23(PoFbx23)在菌丝生长、无性发育、纤维素酶基因的转录以及纤维素酶合成等生命过程中的功能。PoFbx23定位于细胞核内,PoFbx23编码基因缺失(Δfbx23)菌株的生物量与出发株无区别,但无性分生孢子的生成受损,孢子数量下降。Δfbx23突变株中,位于孢子发生中心调控途径中的重要转录因子BrlA编码基因的转录显著下调,提示PoFbx23通过影响孢子发生中心途径间接调控分生孢子的生成。同时,孢子色素合成相关的双羟基萘烯(DHN)-黑色素合成通路(abr2→abr1→ayg1→arp1→arp2→alb1)中的各基因的转录水平也下调。相较出发株,Δfbx23突变株的纤维素酶、半纤维素酶和胞外蛋白分泌量显著提高,qPCR结果显示主要外切纤维素酶基因cbh1和内切纤维素酶基因eg1的转录量显著上调,表明PoFbx23通过调控纤维素酶编码基因的表达影响纤维素酶的合成。转录组数据也支持了Δfbx23突变株中主要纤维素酶和半纤维素酶基因表达上调。最主要的两个外切纤维素酶基因cbh1和cbh2、两个内切纤维素酶基因eg1/cel7B和eg2/cel5B、内切β-葡萄糖苷酶基因bgl1、木聚糖酶基因xyn10A和xyn11A、辅助纤维素降解的裂解多糖单加氧酶(LPMO)基因AA9均显著上调GMO biosafety。此外,PoFbx23还与次级代谢基因簇的表达相关。草酸青霉基因组中预测的28个基因簇中,有4簇在Δfbx23突变株中表达下调。相较出发株,Δfbx23突变株中转录因子PoAce1的蛋白丰度提高,但ace1基因的转录量并未上升。结果提示,Pofbx23基因的缺失主要在蛋白合成/降解水平影响了 PoAce1的丰度。提出了转录因子Ace1受泛素连接酶SCFFbx23控制,调控纤维素酶基因表达的可能机制:转录抑制因子Ace1的无活性前体经SCFFbx23识别被泛素化,后被蛋白酶体降解成有活性状态,行使其抑制纤维素酶基因表达的功能。3.转录因子CrzA的相互作用蛋白的捕捉和鉴定钙-钙调蛋白-钙调磷酸酶(calcium-calmodulin-calcineurin)信号途径能够感知环境信号并相应地协调真菌生长、发育和代谢,是真菌中保守的级联途径。转录因子Crz1/CrzA(calcineurin-responsive zinc finger)是该途径下游最重要的靶标之一,参与多种真菌的各种生命过程,如菌丝生长、细胞壁完整性、有性/无性发育、钙稳态、抗逆性、毒力、次级代谢产物合成等。对于转录因子CrzA功能的研究一直是丝状真菌研究领域中的热点。在实验室前期鉴定了草酸青霉CrzA(PoCrzA)基本生物学功能的研究基础上,通过TAP-MS技术捕获并鉴定了与PoCrzA具有相互作用的蛋白。发现了 50个与PoCrzA具有潜在相互作用的蛋白,其中包括:钙调磷酸酶的催化亚基(Cna1,calcineurin A)、钙调磷酸酶的调节亚基(Cnb1,calcineurin B)、14-3-3蛋白Bmh1。还发现了两种与核蛋白运输相关的蛋白—核输出蛋白Los1和核输入蛋白Srp1、两种磷酸激酶Fus3和Slt2p、以及转录辅因子Tup1-Cyc8复合物的亚基Cyc8。基于TAP-MS结果,绘制了草酸青霉中钙调磷酸酶-转录因子CrzA通路,提出了 Tup1-Cyc8复合物可能作为PoCrzA的辅因子参与转录调控的猜想。