研究目的:研究表明,肥胖和2型糖尿病患者发生认知功能减退及痴呆的风险显著增加,中枢胰岛素抵抗可能在其中发挥重要作用。然而,现阶段对于中枢胰岛素抵抗引起认知障碍的机制尚不清楚。GLP-1受体激动剂作为一种新型降糖药,在2型糖尿病患者认知功能Tamoxifen核磁上的获益逐渐受到关注,然而对于其神经保护作用的具体机制仍需进一步探索。线粒体质量控制系统是维持线粒体稳态的重要环节,对于神经元功能的维持也至关重要。因此,本研究在体内及体外建立中枢胰岛素抵抗模型,并应用GLP-1受体激动剂艾塞那肽干预,观察中枢胰岛素抵抗对认知障碍、神经元功能的影响以及艾塞那肽在该过程中的保护作用及潜在机制,探讨线粒体质量控制系统的作用。研究方法:(1)中枢胰岛素抵抗小鼠模型建立及艾塞那肽干预:6周龄雄性C57BL/6J小鼠,随机分为对照组(Control组)、高脂组(High fat diet,HFD组)、艾塞那肽组(Exenatide,EXE组)。Control组给予低脂饲料,其余两组给予高脂饲料。每4周行口服葡萄糖耐量试验(Oral glucose tolerance test,OGTT)检查。饲养16周后,EXE组给予艾塞那肽腹部皮下注射,其余两组给予生理盐水作为对照。继续饲养4周后处死小鼠,分别检测血糖、血脂以及胰岛素水平;体外胰岛素刺激后利用Western blot检测皮质及海马胰岛素信号通路相关蛋白的表达情况。(2)小鼠空间记忆障碍及脑组织损伤评估:利用Morris水迷宫实验评估小鼠空间记忆能力;通过HE染色以及尼氏染色观察皮质及海马结构改变;通过Western blot以及脑切片免疫荧光检测皮质及海马突触可塑性相关蛋白表达以评估突触功能。(3)小鼠脑组织线粒体结构、氧化应激水平及线粒体质量控制系统检测:通过透射电镜观察小鼠皮质及海马线粒体结构;脑切片荧光探针检测ROS生成含量;试剂盒检测皮质及海马氧化指标H_2O_2、MDA以及抗氧化指标CAT、SOD水平;Western blot以及免疫组化检测皮质及海马线粒体质量控制系统相关蛋白的表达情况;脑切片免疫荧光观察线粒体自噬情况。(4)体外实验验证:建立神经元和星形胶质细胞共培养体系,模拟体内微环境;给予0.1m M的棕榈酸建立胰岛素抵抗模型并给予艾塞那肽干预,通过Western blPerinatally HIV infected childrenot检测胰岛素信号通路相关蛋白表达以明确中枢胰岛素抵抗情况;免疫荧光观察神经元形态;Western blot检测神经元突触可塑性相关蛋白表达;试剂盒检测氧化应激水平;Western blot检测线粒体质量控制系统相关蛋白表达;荧光染色观察线粒体形态。(5)调控SIRT1/PGC-1α通路观察对中枢胰岛素抵抗引起线粒体稳态失衡以及神经元损伤的影响:在体内及体外建立中枢胰岛素抵抗模型,通过Western blot检测SIRT1、PGC-1α蛋白的表达;免疫Bcl-2抑制剂共沉淀检测PGC-1α乙酰化水平;体外免疫荧光检测神经元PGC-1α核转位情况。体外神经元中过表达SIRT1,通过Western blot检测线粒体质量控制系统相关蛋白的表达情况;试剂盒检测氧化应激水平;免疫荧光检测神经元形态;Western blot检测神经元突触可塑性相关蛋白表达。(6)调控SIRT1/PGC-1α通路对艾塞那肽恢复线粒体稳态、改善神经元损伤的影响:在体内及体外建立中枢胰岛素抵抗模型并给予艾塞那肽干预,通过Western blot及免疫共沉淀检测SIRT1/PGC-1α通路相关蛋白表达;体外免疫荧光检测PGC-1α核转位情况。体外神经元中敲低SIRT1,通过Western blot检测线粒体质量控制系统相关蛋白的表达;试剂盒检测氧化应激水平;免疫荧光检测神经元形态;Western blot检测神经元突触可塑性相关蛋白表达。研究结果:(1)HFD组小鼠呈现体型肥胖、空腹血糖升高、血脂紊乱及外周胰岛素抵抗等表型;此外,皮质及海马胰岛素通路相关蛋白表达降低提示高脂饮食可以诱导中枢胰岛素抵抗。艾塞那肽干预可以减轻小鼠肥胖程度,改善血糖、血脂及外周胰岛素抵抗情况,增加皮质及海马胰岛素通路相关蛋白表达以改善中枢胰岛素抵抗。(2)中枢胰岛素抵抗引起小鼠出现空间记忆障碍;皮质及海马组织神经细胞形态异常且数量少,神经元尼氏体含量减少;组织内突触可塑性相关蛋白表达下降提示突触功能受损。艾塞那肽干预后小鼠空间记忆障碍得到显著改善,神经细胞形态及突触功能有所恢复。(3)中枢胰岛素抵抗导致小鼠皮质及海马线粒体形态结构损伤;ROS含量增加,氧化指标H_2O_2、MDA增加,抗氧化指标CAT、SOD减少,提示氧化应激水平增加;线粒体融合相关蛋白MFN2表达降低,线粒体分裂相关蛋白DRP1(Ser616)表达增高;线粒体生物合成相关蛋白NRF1表达下降;Pink1、Parkin蛋白表达降低,P62以及LC3蛋白表达增加,免疫荧光显示线粒体与自噬体共定位系数增加,自噬体与溶酶体共定位系数减少。艾塞那肽干预后小鼠皮质及海马线粒体结构损伤及功能障碍均得到显著缓解。(4)体外共培养体系中加入0.1m M棕榈酸作用24小时后神经元发生胰岛素抵抗,表现为神经元形态异常,突触功能受损,氧化应激水平增加,线粒体质量控制系统失调,线粒体形态发生碎片化。艾塞那肽干预可减轻神经元胰岛素抵抗程度,改善神经元形态及突触功能,减轻氧化应激,改善线粒体质量控制系统以恢复线粒体稳态。(5)中枢胰岛素抵抗可抑制SIRT1/PGC-1α通路进而引起线粒体稳态失衡以及神经元损伤;体外过表达SIRT1可改善SIRT1/PGC-1α通路的抑制状态,恢复线粒体稳态,抑制氧化应激,改善神经元形态及突触功能。艾塞那肽干预可缓解中枢胰岛素抵抗对SIRT1/PGC-1α通路的抑制作用,从而改善神经元线粒体稳态及突触功能。研究结论:(1)中枢胰岛素抵抗可以引起学习记忆能力下降及认知功能障碍,GLP-1受体激动剂艾塞那肽可以缓解胰岛素抵抗水平及改善认知功能;(2)线粒体稳态失衡及线粒体质量控制体系受损在中枢胰岛素抵抗引起线粒体功能障碍并加速神经元损伤过程中发挥重要作用;(3)中枢胰岛素抵抗通过抑制SIRT1/PGC-1α通路介导了线粒体稳态失衡,最终引起神经元损伤及突触功能障碍;(4)艾塞那肽通过SIRT1/PGC-1α通路以调控线粒体稳态改善神经元损伤。