目的:构建艰难拟梭菌fliL基因及CD630＿RS03050基因的敲除菌株ΔfliL及ΔCD630＿RS03050,并在ΔfliL及ΔCD630＿RS03050基础上构建回补菌株::fliL及::CD630＿RS03050。通过比较野生型菌株CD630、敲除菌株(ΔfliL及ΔCD630＿RS03050)及回补菌株(fliL及::CD630＿RS03050)的生理、生化、转录、毒力等方面的差异,探究fl确认细节iL基因及CD630＿RS03050基因在艰难拟梭菌生长、繁殖、毒力及致病中的生物学功能。方法:首先,以艰难拟梭菌pyr F基因为靶基因,采用同源重组方法构建pyr F敲除菌株,作为后续基因研究的底盘细胞;然后,以pyr F突变菌株为基础,利用非等长同源臂偶联等位交换(Allele-coupled exchange,ACE)方法分别构建fliL基因和CD630＿RS03050基因缺失菌株?fliL和?CD630＿RS03050,以及回补菌株::fliL和::CD630＿RS03050;再次,利用生理生化分析技术,分别分析野生菌株CD630、敲除菌株(?fliL、?CD630＿RS03050)回补菌株(::fliL、::CD630＿RS03050)的表型变化,包括:形态变化、生长速率、抗生素敏感性、p H耐受性、运动能力、产胞特性、产气能力、毒力变化等。最后,为了研究CD630＿RS03050基因突变对艰难拟梭菌转录水平的影响,我们利用高通量转录组测序技术,对野生菌株(CD630)、敲除菌株(?CD630＿RS03050)进行了转录组测序,从转录水平进一步分析CD630＿RS03050基因的功能。结果:采用同源重组技术成功构建艰难拟梭菌pyr F基因突变菌株Δpyr F,以Δpyr F作为底盘细胞采用ACE技术成功获得fliL及CD630＿RS03050基因的敲除菌株及回补菌株:?fliL、?CD630＿RS03050、::fliL及::CD630＿RS03050。艰难拟梭菌fliL基因敲除后,ΔfliL生长速率及最大生物量均小于CD630,::fliL回补菌株生长情况回复至野生型。与CD630菌株相比,ΔfliL对阿莫西林、氨苄青霉素、诺氟沙星的敏感性提高,对卡那霉素、四环素敏感性降低,::fliL抗生素敏感性部分selleck NMR回复至野生型水平。另外,ΔfliL运动能力显著降低,::fliL运动能力超越野生型CD630菌株。相比CD630,ΔfliL在p H为5时耐受能力显著提高,在p H为9时,耐受能力显著降低。除此之外,fliL产胞能力较CD630显著降低,::fliL产胞能力部分恢复。艰难拟梭菌CD630＿RS03050基因敲除后,ΔCD630＿RS03050菌株的自溶率低于野生型CD630,在耐受抗生素的能力方面与CD630有明显的差异。在运动能力方面,突变菌株表现出较高的运动能力,CD630 RS03050基因回补后运动能力则更接近CD630。突变株产生的气体体积和硫化氢量明显高于CD630,通过细胞毒性实验和Western blot实验验证ΔCD630＿RS03050产生的毒素量降低。当CD630＿RS03050基因被补充后,上述表型均回复或部分回复至野生型。转录组结果进一步验证表型变化提示相较于CD630,ΔCD630＿RS03050突变菌株中246个基因表达下调同时187个基因表达上调。CD630＿RS03050基因功能障碍后,影响到细胞质膜、细胞周边结构、磷壁酸的代谢过程、脂磷壁酸的合成过程和丝local infection氨酸的半胱氨酸生物合成过程等从而导致艰难拟梭菌在表面结构、自溶速率、运动能力、硫化氢产量及毒素释放等表型产生变化。结论:艰难拟梭菌flil基因在其生长繁殖、适应环境、运动及产孢能力均具有重要作用。CD630＿RS03050显著影响菌株自溶、环境耐受能力、运动能力、硫代谢及毒力等生理生化活动。综上,本研究中fliL基因和CD630＿RS03050基因调控的生理和生化表型对艰难拟梭菌的感染和复发及其关键,并进一步影响艰难拟梭菌菌株的致病性,本研究可能为艰难拟梭菌的防治提供新的方案。