目的:探索PM_(2.5)暴露对心脏纤维化影响及铁自噬依赖性铁死亡的调控机制。方法:1.构建动物模型:随机将42只6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠分为:洁净空气组(FA)、未过滤空气组(UA)和浓缩PM_(2.5)组(CA),洁净空气+铁抑制剂组(FAM)、洁净空气+二甲基亚砜组(FAD)、浓缩PM_(2.5)+铁抑制剂组(CAM)和浓缩PM_(2.5)+二甲基亚砜组(CAD),共7组,每组6只,持续暴露16周,每周7天,每天6小时(h)。在小鼠染毒期间,每周利用空气动力学粒径谱仪检测暴露仓内粒径分布,每天使用气溶胶探测器监测暴露仓内PM_(2.5)浓度,同时记录染毒仓内温湿度。2.PM_(2.5)采集与制备:暴露同期,使用高流量PM_(2.5)采样系统对颗粒物进行采集,采样器流速为1.05 m~3/min,每天采样12 h。通过超声和冷冻干燥法提取后制备成浓度为20 mg/m L的PM_(2.5)原液。3.构建细胞模型和重组细胞株:在37℃、5%CO_2条件下,采用含10%小牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified eagle media)培养基培养小鼠心肌细胞系HL-1细胞。取对数生长期Ceralasertib采购的细胞,PM_(2.5)(0、50、100和200μg/m L)处理24 h。采用si RNA转染HL-1细胞,构建NCOA4和YY1低表达细胞株。4.心脏超声检测小鼠心脏功能,HE和Masson染色检测小鼠心脏组织病理结构和胶原纤维沉积水平。5.Western blot检测小鼠心脏组织中纤维化标志物:α-SMA、Collagen I;小鼠心脏组织和HL-1细胞中促纤维化蛋白TGF-β;小鼠心脏组织和HL-1细胞中铁死亡标志物:TFRC、SLC40A1、SLC7A11/Xct和GPX4;小鼠心脏组织和HL-1细胞中铁自噬标志物:NCOA4和FHC,以及YY1的表达水平。6.BD Accuri?C6流式细胞仪(Becton,USA)检测小鼠心脏组织和HL-1细胞活性氧水平。将小鼠心脏组织制备成10%的匀浆,TBA法检测MDA水平。7.将小鼠心脏组织研磨、离心后取上清,比色法检测小鼠心脏组织中二价铁的含量。8.免疫荧光检测小鼠心脏组织中4-HNE的水平。免疫金标技术检测NCOA4和FHC在自噬溶酶体中的共定位情况。9.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)实验检测HL-1细胞YY1和NCOA4的直接结合作用。结果:1.FA、UA、CA组平均暴露浓度分别为0、12.03和89.82μg/m~3。暴露期间,FA组未检测到颗粒物质,UA组暴露仓内粒径小于2.5μm颗粒物的检出率为94.78%,CA组暴露仓内粒径小于2.5μm颗粒物的检出率为99.82%。2.超声心动图结果显示,与FA组相比,UA组和CA组小鼠的每搏输出量(SV)、射血分数(EF)和短轴缩短分数(FS)明显降低(P<0.05),表明PM_(2.5)暴露后心功能明显降低。HE染色结果显示,CA组小鼠心脏出现明显病理改变:心肌纤维排列紊乱,有炎性细胞浸润。Masson染色结果显示,UA组和CA组小鼠心脏中胶原大量沉积。3.与FA组相比,UA和CA组小鼠心脏组织中α-SMA和Collagen I的水平明显增加(P<0.05);PM_(2.5)(50 ug/m L,100 ug/m L,200 ug/m L)梯度处理HL-1细胞24 h,TGF-β的水平随PM_(2.5)呈剂量依赖性增加(P<0.05)。4.体内外结果显示,PM_(2.5)处理后小鼠心脏组织和HL-1细胞铁死亡标志物TFRC水平显著增加,SLC7A11、SLC40A1和GPX4水平显著降低(P<0.05)。与FA组相比,UA组和CA组小鼠心脏组织中MDA、ROS和Fe~(2+)水平显著增加(P<0.05)。CA组小鼠心脏组织的4-HNE的水平明显高于FA组和UA组(P<0.05)。5.超声心动图结果显示,与CAD组相比,CAM组小鼠心脏的每搏输出量(SV)、射血分数(EF)和短轴缩短分数(FS)分别相对增加了1.27倍、1.24倍和1.12倍(P<0.05)。铁抑制剂(Fer-1)明显缓解PM_(2.5)暴露导致的心脏功能下降。HE染色结果显示,与CAD组小鼠相比,CAM组小鼠心脏组织的病理改变明显减轻。Masson染色显示,CAM组小鼠心脏胶原沉积明显减少。6.与CAD组相比,CAM组小鼠心脏的MDA和ROS水平分别降低55.7%和10.5%(P<0.05),铁抑制剂(Fer-1)处理减轻了PM_(2.5)诱导的Fe~(2+)的升高。免疫荧光结果显示,与CAD组相比,CAM组小鼠心脏中4-HNE水平降低54.7%(P<0.05)。Western Blot结果显示,与CAD组相比,CAM组小鼠心脏中TFRC水平降低26.8%(P<0.05);SLC7A11、SLC40A1和GPX4的水平分别升高2.2倍、2.04倍和2.15倍(P<0.05)。此外,与CAD组小鼠相比,CAM组小鼠心脏中Collagen I、α-SMA和TGF-β水平显著降低(P<0.05)。7.体内外结果显示,PM_(2.5)处理后小鼠心脏组织和HL-1细胞铁自噬标志物NCOA4水平呈剂量依赖性显著增加,而FHC水平呈剂Cell Cycle抑制剂量依赖性显著降低(P<0.05)。此外,免疫电镜结果显示,FA组小鼠心脏中FHC和NCOA4蛋白定位于胞质中。在CA组小鼠心脏组织的自噬小体中可以观察到FHC和NCOA4蛋白。PM_(2.5)处理后,si NCOA4组中TFRC水平较NC组下降56.68%(P<0.05);SLC7Medullary thymic epithelial cellsA11、SLC40A1和GPX4水平分别相对增加2.01倍、1.99倍和2.49倍(P<0.05)。8.与FA组小鼠相比,CA组小鼠心脏YY1水平明显升高(P<0.05)。在体外实验中,PM_(2.5)导致HL-1细胞中YY1水平以剂量依赖性的方式升高(P<0.05)。9.免疫共沉淀实验显示,YY1与NCOA4具有直接的相互作用。Western Blot结果显示,PM_(2.5)处理后,si YY1组NCOA4水平较NC组下降35.5%(P<0.05);si YY1组FHC水平比NC组增加了1.3倍(P<0.05)。结论:1.PM_(2.5)暴露诱导心脏纤维化。2.PM_(2.5)导致的心脏纤维化与铁死亡有关。3.PM_(2.5)可能通过激活YY1促进心肌细胞自噬依赖性铁死亡导致心脏纤维化。