研究目的1.研究胰腺癌组织和癌旁组织中微生物组多样性,以及新辅助/转化治疗后癌组织和癌旁组织中微生物组多样性的变化。2.获得胰腺癌肿瘤内细菌的纯培养菌株,建立胰腺癌临床分离菌株库。3.研究临床分离菌株E.hormaechei A64对核苷类似renal biomarkers物化疗药吉西他滨和5-氟尿嘧啶的代谢机制和抗肿瘤活性的影响。研究方法1.通过16S rDNA测序和QIIME2流程分析直接手术和新辅助/转化治疗患者癌组织和癌旁组织中的微生物组α多样性、β多样性、微生物群落组成和物种差异;通过Bugbase工具对菌群表型进行预测分析;通过PICRUSt2工具对胰腺癌组织中菌群的功能进行预测分析。2.通过微生物培养技术,从胰腺癌患者的癌组织和癌旁组织中分离、获得纯培养菌株;采用细菌16S rDNA测序技术,鉴定临床分离菌株的物种信息;通过制备临床分离菌株的鼠源多克隆抗血清并应用于免疫组化、免疫荧光检测,验证胰腺癌组织内细菌的存在;通过荧光D-氨基酸标记、细菌生化鉴定、细菌药敏试验对代表菌株的形态、生化功能和抗生素耐药进行分析;通过全基因组测序技术获得临床分离菌株E.hormaechei A64的全基Nirogacestat供应商因组序列。3.通过测定细菌生长曲线研究吉西他滨对临床菌株生长的影响;通过液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)检测吉西他滨及其无活性代谢物dFdU的浓度变化,研究临床分离菌株对吉西他滨的转化和代谢;通过制备吉西他滨的细菌调节培养基(bacteria conditioned media,BCM)和CCK8法检测细胞增殖和活力,研究临床分离菌株对吉西他滨体外抗肿瘤作用的影响;通过微生物体内同源重组基因打靶技术,研究临床分离菌株E.hormaechei A64代谢吉西他滨的关键基因;通过定点突变/环状诱变、重组蛋白表达和纯化、表面等离子共振、酶活力检测、蛋白印迹检测等技术,研究临床分离菌株E.hormaechei A64代谢吉西他滨的分子机制。4.通过测定细菌生长曲线,研究5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)对临床菌株生长的影响;通过荧光定量PCR技术(RT-q PCR),研究5-FU代谢相关基因在胰腺癌细胞中的表达情况;通过制备5-FU的细菌调节培养基(bacteria conditioned media,BCM)和CCK8法检测细胞增殖和活力,研究临床分离菌株对5-FU体外抗肿瘤活性的影响;通过腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶碱基补充实验,分析临床分离菌株E.hormaechei A64对5-氟尿嘧啶的代谢通路。5.通过裸鼠皮下移植瘤、细菌瘤内注射和小动物活体成像技术,研究E.hormaechei A64在移植瘤中的驻留及其对移植瘤生长的影响,以及E.hormaechei A64对吉西他滨、5-氟尿嘧啶体内抗肿瘤活性的影响。结果1.胰腺癌组织中微生物多样性的测序研究(1)直接手术患者不同发生部位(胰头/颈vs胰体/尾)的癌组织之间、癌旁组织之间比较,α多样性、β多样性组成均无显著差异。(2)直接手术患者癌组织的α多样性指数sobs、chao、shannon、shannoneven显著高于癌旁组织(p<0.05),coverage、pd指数比较无显著差异。癌组织和癌旁组织的β多样性组成存在显著差异。采用bray＿curtis距离算法时,非度量多维尺度分析(non-metric multidimensional scaling,NMDS)的stress值为0.096,Adonis法检验组间差异得到R~2=0.0454,P=0.01,提示直接手术患者癌组织和癌旁组织的β多样性组成差异程度有限。(3)直接手术患者癌组织中,变形菌门占比显著低于癌旁组织(76.98%vs89.02%,p=0.000701),厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门占比均显著高于癌旁组织(17.84%vs 8.54%、3.25%vs 0.87%、1.26%vs 0.86%,p<0.05)。LEfse分析结果提示厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门以及肠杆菌科的志贺菌属/埃希氏菌属是直接手术患者癌组织相较于癌旁组织的特征物种。Bugbase表型预测直接手术患者癌组织中革兰阳性菌、厌氧菌比例显著高于癌旁组织。PICRUSt2菌群功能预测通路富集分析结果癌组织和癌旁组织相似。(4)新辅助/转化治疗后癌组织和癌旁组织中的α多样性指数比较无显著差异,β多样性相似。(5)新辅助/转化治疗后患者癌组织中的菌群α多样性指数sobs、chao、shannon、shannoneven、pd指数均显著高于直接手术患者(p<0.001),coverage指数显著低于直接手术患者(p<0.001)。采用unweighted＿unifrac距离算法和ANOSIM法检验组间差异,NMDS分析结果表明新辅助/转化治疗后患者癌组织的β多样性组成显著不同于直接手术患者的癌组织(stress=0.051,R=0.9781,P=0.001)。(6)新辅助/转化治疗后患者癌组织中变形菌门和厚壁菌门占比显著低于直接手术患者(43.29%vs 77.05%、6.25%vs 17.86%,p<0.0001)。新辅助/转化治疗后患者癌组织中拟杆菌门和放线菌门占比均显著高于直接手术患者(11.11%vs 3.25%、6.80%vs 1.26%,p<0.05)。新辅助/转化治疗后患者癌组织中的梭杆菌门、弯曲杆菌门丰度显著高于直接手术患者癌组织(p<0.001)。Bugbase表型预测新辅助/转化治疗后患者癌组织中兼性厌氧菌、需氧菌、潜在致病菌和具有生物膜形成能力的细菌比例均显著高于直接手术患者癌组织。PICRUSt2菌群功能预测通路富集分析结果新辅助/转化治疗后癌组织中的菌群功能与直接手术患者癌组织中的菌群功能有明显的区分。2.胰腺癌组织内细菌分离培养鉴定和临床分离菌株库的建立(1)经过对44例患者癌组织和癌旁分离培养,得到纯培养菌株共计429株,其中癌组织分离得到224株,癌旁组织分离得到205株。(2)429株细菌共比对到42个种(species),数量较多的有霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)91株,弗格森氏埃希氏菌(Escherichia fergusonii)62株,痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes)59株,表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)32株,缓症链球菌(Streptococcus mitis)32株,高丽节杆菌(Arthrobacter koreensis)23株,蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)21株。(3)44例患者中,20例患者的组织中分离得到痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes),14例患者分离到表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis),6例患者的组织中分离到蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),5例患者的组织中分离得到霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei)。(4)免疫组化和免疫荧光实验确证了霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei A64)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis B13)、痤疮丙酸杆菌(Cutibacterium acnes B16)在胰腺癌组织和癌旁组织中存在。(5)Enterobacter hormaechei A64的生化鉴定结果符合肠杆菌科定义。药敏试验结果提示Enterobacter hormaechei A64为多重耐药菌。3.临床分离菌株E.hormaechei A64对吉西他滨的代谢机制和体外抗肿瘤活性影响(1)检测25株临床分离菌,霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei A64)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae B80)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii E18)、默林氏柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae B79)、尼泊尔葡萄球菌(Staphylococcus nepalensis B17)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa C9)的生长不受吉西他滨抑制,其余菌株的生长均受到不同程度抑制。(2)霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei A64)、默林氏柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae B79)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae B80)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus C4)可以迅速降低培养基中吉西他滨的浓度,并将其转化成无活性的代谢产物dFdU。(3)Enterobacter hormaechei A64显著削弱吉西他滨对胰腺癌细胞的增殖抑制作用。(4)E.hormaechei A64 cdd缺失菌株不能将吉西他滨转化为dFdU,也不影响吉西他滨的抗肿瘤活性。(5)重组表达得到的E.hormaechei A64胞嘧啶核苷脱氨酶Cdd与吉西他滨有较强的亲和力,并且能够迅速将吉西他滨转化为无活性的代谢产物dFdU。(6)E.hormaechei A64胞嘧啶核苷脱氨酶Cdd在不同氧需求培养条件下的蛋白水平无显著差异。4.临床分离菌株E.hormaechei A64对5-FU体外抗肿瘤活性影响和代谢机制研究。(1)检测25株临床分离菌,5-FU对大多数菌株的生长有显著抑制,仅对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae B80)无抑制。(2)不同胰腺癌细胞株对5-FU的敏感性不同。5-FU代谢相关基因在胰腺癌细胞中m RNA水平不同,5-FU激活和灭活的关键基因TP和DPD表达水平的比率(TP/DPD)仅在MIA PaCa-2中小于1。(3)5-氟尿嘧啶与E.hormaechei A64孵育后对PANC-1、MIA PaCa-2、CFPAC-1、Bx PC-3胰腺癌细胞的增殖抑制作用显著增强。(4)5-氟尿嘧啶与E.hormaechei A64孵育后上清的抗肿瘤活性变化与孵育时间相关。(5)补充尿嘧啶可以对抗5-氟尿嘧啶对E.hormaechei A64的生长抑制,而补充胸腺嘧啶则无此作用。5.临床分离菌株E.hormaechei A64对吉西他滨和5-氟尿嘧啶在免疫缺陷荷瘤小鼠中抗肿瘤作用的影响(1)携带萤光素酶质粒的E.hormaechei A64与移植瘤一起接种后,可在第3天、第7天在移植瘤接种部位观察到萤光。移植瘤实验终点可分离出E.hormaechei A64活菌。(2)瘤内注射E.hormaechei A64或E.hormaechei A64Δcdd移植瘤的体积(Tumor Volume,TV)和相对肿瘤体积(Relative Tumor Volume,RTV)在各时间点与对照组均无显著差异(3)未予瘤内注射细菌的吉西他滨给药组(Gem 150 mg/kg)和瘤内注射E.hormaechei A64Δcdd组(Gem 150 mg/kg+A64Δcdd i.t)移植瘤SAHA体外TV和RTV与对照组NC在接种26天后开始有显著差异,并一直保持到实验终点。瘤内注射野生型菌株E.hormaechei A64组(Gem 150 mg/kg+A64 WT i.t)移植瘤RTV与NC组在各时间点均无显著差异;移植瘤TV仅在终点处理当天有显著差异(p<0.05)。(4)5-FU给药组(5-FU 25 mg/kg、5-FU 50 mg/kg)移植瘤TV和RTV在各时间点与NC组比较均无显著差异。瘤内注射野生型E.hormaechei A64后,50 mg/kg给药组(5-FU 50 mg/kg+A64 WT i.t)在第36、39、41天的移植瘤TV和RTV与NC组有显著差异,20 mg/kg给药组(5-FU 50 mg/kg+A64 WT i.t)在第39、41天的移植瘤TV和RTV与NC组有显著差异。结论1.直接手术患者癌组织和癌旁组织内微生物组多样性存在显著差异,新辅助/转化治疗显著改变胰腺癌组织内的微生物组多样性。2.从胰腺癌/癌旁组织获得纯培养菌株共计429株,建立了胰腺癌临床分离菌株库。3.E.hormaechei A64可在肿瘤内长期存在,对不同化疗药疗效具有截然不同的调节作用,一方面能削弱吉西他滨的抗肿瘤活性,另一方面又能增强5-FU的抗肿瘤活性。