碳水化合物活性酶(CAZymes)是可以构建、分解和修饰碳水化合物的一系列酶。作为CAZymes数据库中最大的家族,糖基水解酶(GH)家族可以通过水解反应催化复杂碳水化合物的降解以及通过转糖苷反应催化碳水化合物和糖缀合物的合成。近年来,因其可以利用廉价的淀粉和蔗糖作为糖基供体底物催化转糖苷反应,GH家族受到国内外学者的持续关注。淀粉蔗糖酶(Amylosucrase,AS,EC 2.4.1.4)是GH13家族的一种多功能酶,可以以廉价的蔗糖为底物,催化聚合、异构和转糖苷等多种类型的反应,用于生产功能性甜味剂、膳食纤维、基于碳水化合物的包埋材料和生物活性物质等,在食品行业有着广泛的应用潜力。然而,目前已被报道发现的大多数AS都表现出较差的热稳定性,这使该酶的实际工业应用受到了很大的限制。近年研究表明,大多数的耐热蛋白具有更高的寡聚状态,亚基间相互作用也被认为是稳定耐热蛋白的主要机制之一。目前,虽然已有AS的晶体结构得到解析,催化机理也得到了初步探索,然而关于AS的寡聚状态与热稳定性之间的关系仍未被阐明。热稳定性普遍优秀的二聚体AS未能被深入研究,目前已有的分子改造研究也未能涉及到四级结构。因此,本论文基于二聚体AS的亚基界面区域的特征,在NCBI数据库挖掘出新的耐热AS;接着解析其晶体结构,揭示参与界面接触的残基与其四级组装模式;然后通过截短和替换突变,探究这些残基对热稳定性的作用;最后利用计算辅助的理性设计,重点加固相对较弱的亚基接触面,提升AS的热稳定性。具体的研究内容与结论如下:(1)耐热四聚体淀粉蔗糖酶CT-AS的性质鉴定。基于二聚体AS的特征界面长loop区域,选取来自嗜热微生物Calidithermus timidus DSM 17022中的推定AS蛋白(CT-AS),将其编码基因构建重组质粒,selleck NVP-TNKS656在E.coli BL21(DE3)中异源表达,并经过亲和层析进行分离纯化。CT-AS的最适p H为7.0,最适温度为55°C。当蔗糖为唯一底物时,CT-AS主要催化聚合反应,生成α-1,4-葡聚糖;在体系中加入额外的果糖,有助于异构化反应,生成松二糖。通过凝胶排阻色谱及静态光散射分析,显示CT-AS在溶液中以四聚体状态存在,为目前首个四聚体AS。CT-AS的T_m值为74.47°C,在60°C时的t_(1/2)为46.21 h,均为目前报道的AS中最好。(2)四聚体淀粉蔗糖酶CT-AS的晶体结构解析。解析出分辨率为2.29?~2的CT-AS的三维结构数据。CT-AS的晶体结构的每个不对称单元由四个亚基组成,亚基之间两两形成亚基接触面,共有两种接触面,一种在二聚体AS中也存在,称为二聚体内界面;而另一种为四聚体AS独有,称为二聚体间界面。二聚体间界面显示出良好的形状互补,主要相互作用为疏水相互作用及氢键相互作用,二聚体间界面的掩埋面积约为二聚体内界面的掩埋面积的一半。四聚体CT-AS与GH13家族其他四聚体蛋白的四级结构具有明显的区别,揭示出该家族中的一种未被报道的亚基组装模式。(3)定点突变探究亚基间残基对CT-AS热稳定性的影响。通过对二聚体内界面的特征长loop区进行域截短、域替换突变,证明其对热稳定性具有较大的影响,突变体的T_m值最多降低了14.79°C,但其在溶液中寡聚状态未受到影响。通过对二聚体间界面的参与氢键相互作用的5个残基进行丙氨酸扫描,所得突变体的T_m值最多降低了5.50°C。并且,5点组合突变及N577A的单点突变使CT-AS在溶液中以单亚基存在,说明相对二聚体间界面的相互作用的拆散会对蛋白的寡聚状态造成影响。尽管优化残基577难以提高CT-AS的热稳定性,但足以说明二聚体间界面是相互作用是相对较弱的,很有希望成为亚基界面加固的突破口。(4)理性设计提升CT-Aselleck SB431542S的热稳定性。基于5种常见策略,包括亚基界面加固、折叠自由能优化、疏水作用加强、共进化序列筛选和B因子筛选,进行理性设计,得到12个候选突变体,其中5个突变体具有提高的T_m值。经建模分析,其中热稳定性最好的突变体H631R在二聚体间界面生成了两个新的相互作用。将5个突变有序叠加,最终得到其中热稳定性最好的突变体M31(H631R/L382P/S414N/P618I),其在65°C的t_(1/2)比野生型CT-AS增加了20.02 h。M31在50°C下合成的α-葡聚糖的量和链长都明显优于野生酶,推测是因为这些突变位点是通过多种策略共同选择的,并且Medical tourism都位于远离活性位点的位置。通过分子动力学模拟,突变点对蛋白整体热稳定性的贡献得到了验证,同时说明构建新的亚基间相互作用来加强相对较弱的亚基界面,有效地提高了CT-AS的热稳定性。与其他已报道AS相比,通过理性设计得到的突变体M31已具有极大的工业应用潜力。