随着人类活动的加剧和工业化进程的快速发展,过量的氮素被排放到水体中,给生态平衡和人体健康带来严重危害。因此如何高效可持续去除水体中的氮素污染是环境治理面临的一个重要挑战。生物脱氮法因其绿色环保且经济有效的特点被广泛应用,新型生物脱氮技术尤其是好氧反硝化微生物的发现为生物脱氮提供了新的思路,成为目前污水处理领域研究的热点。然而对于常年处于低温环境或是冬季的水体,中温好氧反硝化菌的生长代谢和脱氮性能会受到严重抑制,难以达到含氮废水生物处理的要求。因此分离筛选耐冷好氧反硝化菌,并对其反硝化脱氮和耐冷机制进行解析,能够为更好实现低温环境下的高效生物脱氮提供理论依据和技术支撑。本研究主要是在筛选获得耐冷反硝化芽孢杆菌的基础上,通过耐冷特性实验结合转录组学分析,阐释该菌在反硝化过程中的耐冷机制,并对预测到的候选反硝化基因进行功能验证,最后对所制备的改性生物炭固定化芽孢杆菌的除氮效能进行了评估,主要研究成果如下:(1)从来源于我国东北地区的高山冻土样品中经过分离筛选和鉴定,获得了一株耐冷简单芽孢杆菌(Bacillus simplex)H-b,该菌在5-37°C范围内对各类无机氮素均能有效去除。在5°C培养168 h,该菌对NO_3~–N、NO_2~–N和NH_4~+-N的去除效率分别达到40.07%、61.56%和73.83%,并且在低温条件下对混合氮源以及实际含氨氮污水均有良好的脱除效果。通过对N_2生成量的测定、氮平衡估算、反硝化基因(nap和nor)扩增以及关键功能酶(HAO、NR和NIR)酶活力表征等的分析,明确菌株H-b中具体反硝化脱氮途径为:NO_3~-～NO_2~-～NO～N_2O～N_2。此外,在低温条件下,以丁二酸钠作为碳源,Na Cl浓度为0-10 g/L,C/N比为15-20,p H为7-9,初始NO_3~–N浓度为10-60 mg/L,摇床转速为150-200 rpm以及Cu~(2+)、Zn~(2+)和Ni~(2+)浓度不超过2 mg/L的条件下,菌株H-b能够取得较佳的氮去除效率。(2)菌株H-b全基因组测序结果表明该菌基因组序列全长为5499613 bp,由一个Antibiotic combination环状染色体组成,基因组上共有5706个编码基因,其中有33个基因可能与菌株H-b的耐冷性相关。对菌株H-b在不同培养温度(5°C、20°C和30°C)下进行好氧反硝化过程转录组测序结果的分析,结合耐冷特性实验结果,发现在低温下菌株H-b大量调整参与膜转运、辅酶和维生素的合成以及转录调控因子相关基因的转录水平。此外,ATP(腺苷三磷酸)的合成、氮素的利用、EPS(胞外聚合物)的合成、脂肪酸组成、核苷酸前体的合成、蛋白翻译、氧化以及温度响应机制也做出了相应地调节。总之,菌株H-b通过调节胞内各项代谢过程共同应对低温生存压力。(3)利用序列比对和蛋白保守结构域分析从菌株H-b基因组序列上共预测到25个候选反硝化基因。首先建立了该菌的原生质体转化法,然后利用同源重组方式成功构建了25个候选基因敲除菌。发现H-bΔnap A2在低温下的生长出现明显的延滞现象,当基因回补后,回补菌株对低温环境的耐受能力有所恢复,说明nap A2是菌株H-b能够在低温下生长和脱氮的重要基因。cba A1敲除后,突变株无法在NO_3~–N和NO_2~–N培养基中生长,同时也无法脱氮,基因回补菌能够重新利用无机氮进行生长,且能通过反硝化途径产生N_2,表明了cba A1在菌株H-b的无机氮代谢过程中具有重要作用。此外,发现nor D、nor Imidazole ketone erastin半抑制浓度Q2、cba A2、cba A3、cba B1、nos F1、nos F3、nos F6、nos F02、nos Y1和nos Y2敲除后,11株突变株通过反硝化途径产生的N_2含量降低了6.06-32.89%不等。(4)以核桃壳为MRTX1133原材料,制备的4种金属改性生物炭中仅有锌和铁改性生物炭具有NO_2~–N吸附性能,在48 h时可以分别将29.13%和92.44%的NO_2~–N从溶液中去除。通过对锌和铁改性生物炭吸附特性和吸附动力学的分析,以对NO_2~–N吸附性能更优良的铁改性生物炭作为载体,制备了固定化B.simplex H-b。在温度为5-37°C以及初始NO_2~–N浓度为5-100 mg/L条件下,固定化菌株H-b相比于纯菌和单纯生物炭具有更高的氮去除效率。且当温度≤20°C以及初始NO_2~–N浓度≥40 mg/L时,改性生物炭上固定有高生物量的菌株H-b时,更有利于固定化细胞的脱氮作用。此外,改性生物炭固定化细胞重复使用10次后,对NO_2~–N的去除率仍能达到97.62%。