维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,A.veronii)是一种广宿主的革兰阴性致病菌,能够感染多种经济鱼类,给水产养殖业带来不可挽回的经济损失,也可感染人在内的多种哺乳动物,威胁公共卫生健康安全。目前,虽然已经鉴定出A.veronii的多种毒力因子,但对该病原菌的致病机理却尚未清晰,这也是限制本研究制定有效环保的防治措施的重要原因。双组份系统(Two-Component systems,TCSs)是原核生物中主要的信号感知-传导系统,Qse B/Qse C双组份由Qse C组氨酸激酶(HK)与Qse B反应调节器(RR)构成,已被证实参与多种致病菌毒力相关基因的转录调控。但目前尚无关于A.veronii Qse BC双组份功能的报道。因此,探究Qse BC双组份在A.veronii中的功能,将有助于本研究进一步了解A.veronii的致病机理。本研究以实验室前期分离的临床野生株TH0426为参考对照株,利用同源重组的方法分别构建A.veronii的qse B、qse C及qse BC基因缺失株与互补株,对其生物学表型变化进行比较分析,鉴定Qse BC双组份对A.veronii生物学表型调控的相关性,进一步利用比较转录组学,探究qse B、qse C及qse BC参与调控A.veronii的相关代谢通路,最后利用Ch IP-Seq筛选Qse B直接结合的靶基因,探究Qse BC双组份对A.veronii调控的分子机制。主要研究内容如下:(1)构建维氏气单胞菌qse B、qse C和qse BC基因缺失株及互补株本研究利用前期对A.veronii TH0426株的全基因组注释结果,找到了A.veronii Qse BC双组份编码的序列,选择自杀性质粒p RE112,构建同源重组载体p RE112-qse B、p RE112-qse C及p RE112-qse BC、通过自然转化的方法分别转入到A.veronii TH0426野生株体内,经过Amp~+与Cm~+抗性平板筛选后,得到缺失株Δqse B、Δqse C与Δqse BC。同时,找出Qse BC双组份基因的启动子与ORF序列,利用PCR分别扩增后,串联至p EASY克隆载体,随后连接至广宿主表达质粒p BBR-MCS1,构建重组质粒p BBR-qse B、p BBR-qse C及p BBR-qse BC,同样,利用自然转化法,分别将重组质粒转化至缺失株Δqse B、Δqse C与Δqse BC体内,经Amp~+与Cm~+抗性平板筛选后,得到互补株C-qse B、C-qse C与C-qse BC。通过DNA与RNA水平,验证基因缺失株与互补株构建成功。(2)野生株、缺失株与互补株生物学特性分析本研究对野生株TH0426;缺失株Δqse B、Δqse C与Δqse BC;互补株C-qse B、C-qse C与C-qse BC的生物学特性进行了比较分析。菌落形态与生长曲线结果表明,qse B、qse C或qse BC基因的缺失,并不能使菌落形态发生改变,但qse B基因缺失后,会显著降低A.veronii在对数期的生长速度;运动能力检测结果表明,qse B、qse C与qse BC基因的缺失,均能够显著降低A.veronii的游动能力,通过鞭毛染色与透射电镜,均能够明显的观察到缺失株的鞭毛发生明显的脱落,表明Qse BC双组份参与了对鞭毛的调控;通过结晶紫微孔板法对野生株、缺失株及互补株的生物被膜形成量进行检测,结果表明qse B与qse C基因的缺失,均能够显著增强A.veronii的生物被膜形成能力,扫描电镜的视野能也同样能够观察到Δqse B、Δqse C形成了大量的生物被膜,通过激光共聚焦显微镜观察分析后,发现Δqse B与ΔDibutyryl-cAMP分子量qse C生物被膜的扩散距离与结构不均一性均增强,而qse BC基因缺失后,却降低了A.veronii的生物被膜形成能力,结果表明Qse BC双组份同样参与了对A.veronii的生物被膜形成的调控;对EPC粘附及侵袭能力检测结果显示,缺失株Δqse B与Δqse C较野生株分别升高1.24倍与1.42倍,而Δqse BC较野生株下降了1.83倍;而细胞毒性试验结果显示,在感染30 min时,缺失株Δqse B、Δqse C及Δqse BC对EPC细胞的毒性较野生株分别下降4.17倍、3.02倍与3.21倍;当感染至1 h时,较野生株分别下降2.36倍、2.02倍与2.46倍;当感染至2 h时,较野生株分别下降1.28倍、0.87倍与1.49倍,而互补株虽然毒性有所恢复,但并未恢复至野生株水平;同样,斑马鱼致病性试验结果显示,Δqse B、Δqse C与Δqse BC的LD_(50)比野生株TH0426分别升高了74、8.5与61倍,表明Qse BC双组份参与了对A.veronii致病能力的调控,似乎在这一过程中,qse B基因发挥了主要的调控作用;细菌载量试验结果显示,缺失株在血液、肝脏、脾脏及肾脏中的细菌载量均显著低于野生株;当感染达24 h与48 h时,缺失株Δqse BC在各组织中的定值量最低;体内竞争试验结果表明,所有的竞争指数均小于1,说明Qse BC双组份能够促进A.veronii在宿主体内的菌间竞争能力。(3)野生株与缺失株比较转录组学研究为了进一步阐明qse B、qse C与qse BC基因缺失后A.veronii表型变化的根本原neurodegeneration biomarkers因,本研究利用RNA-Seq技术对缺失株Δqse B、Δqse C、Δqse BC与野生株TH0426进行比较转录组学研究。与野生型TH0426株相比,缺失株Δqse B中存在差异表达基因924个,包含633个上调表达,291个下调表达;缺失株Δqse C中存在差异表达基因2364个,包含1141个上调表达,1223个下调表达;缺失株Δqse BC中存在差异表达基因152个,包含129个上调表达,23个下调表达。生物信息学分析结果表明,Qse BC参与A.veronii生长性能、趋化性、分泌系统、鞭毛的组装、生物被膜形成等代谢通路的调控,且与A.veronii鞭毛脱落、生物被膜形成增加、毒力减弱等表型一致,表明Qse BC双组份在A.veronii的致病性中发挥重要的调控作用。(4)Ch IP-Seq分析Qse B靶基因为了进一步明确Qse BC对A.veronii的调控机制,本研究利用Ch IP-Seq技术,筛选Qse B调控的潜在靶基因,而这一技术的关键在于需要质量较高的Ch IP级抗体,因此本研究将qse B自身启动子(qse B promoter)与qse B基因编码序列及Flag标签序列串联至p BBR-MCS2载体中,构建重组表达质粒p BBR-MCS-qse B-flag,并电转至缺失株Δqse B菌株内,通过RT-q PCR及Western-blot验证,重组质粒能够在缺失株Δqse B菌株内稳定表达;通过Ch IP-Seq,本研究筛选到1639个Pea K,包含1291个基因,经RNA-Seq与Ch IP-Seq联合分析后,筛选出347个Qse B潜在调控的靶基因,其中包括24个与表型变化根本相关基因,分别为细菌趋化性相关:che Y;鞭毛组装相关基因:flg F、flg G、flg M、flg H、flg E、flg L、fli J、fli F、fli O、fli L、fli B;生物被膜形成相关:glg C、omp A、pts G,crr;sec移位系统:sec G、sec Y、sec A;信号识别蛋白粒子:ffh;双向精氨酸靶向系统:tat B;IV型分泌系统:vgr G、lip、hcp。其中Qse B能够结合到che Y与omp A基因的启动子区域。(5)Qse B调控che Y与omp A基因的表达Qse B作为Qse BC双组份的反应调节因子,不仅可以通过结合启动子来控制基因的表达,还可以直接修饰靶蛋白的功能活性,从而调节下游反应。经RNA-Seq与Ch IP-Seq联合分析后发现,che Y与omp A可能是Qse B的潜在靶基因,并通过EMSA试验证明了Qse B能够与che Y及omp A基因的启动子直接结合;为了进一步明确Qse B对che Y及omp A的调控关系,本研究利用p BBR-lacz报告质粒进行验证,为了消除菌株中lacz基因产生的实验背景,本研究分别构建了野生株TH0426与缺失株Δqse B的lacz基因缺失株Δlacz与Δqse B-lacz;β-半乳糖苷酶实验结果表明,Qse B对che Y与omp A基因启动子发挥激活作用。综上所述,本研究揭示了Qse BC双组份参与调控A.veronii的生长分裂、趋化性、生物被膜形成、鞭毛组装及毒力发挥等多个生物学过程,找出Qse B下游调控的靶基因che Y与omp A,研究结果为进一步明确A.veronii Qse BC双组份的调控机制奠定了基础,同时也为进一Baf-A1分子式步阐明维氏气单胞菌致病机理提供了重要依据。