辨证论治是中医药临床工作的核心dispersed media要求,是理-法-方-证-药的系统整合。方剂作为理-法-方-证-药中的重要一环,既是“辨证”环节抽象思维的具体表达,也是“论治”环节固本疗疾的执行者,而配伍正是方剂实现上述功能的根本途径。因此,阐明方剂的配伍关系与配伍机制对于揭示方剂的科学本质具有重要意义。四逆汤是仲景名方,也是中药方剂配伍应用代表方。四逆汤组方精妙,法度严谨,药虽三味,但方中附子甘草配伍与附子干姜配伍均为中药七情配伍的经典代表,三者互助互制,共奏回阳之功,是中医药现代化研究中的关注热点,本论文也在前期做了大量探索工作。目前相关研究已从附子甘草“相畏/相杀”、附子干姜“相须/相使”的角度对四逆汤的配伍内涵进行了大量阐述,从一定程度揭示了四逆汤的组方原理。但分析发现,现有四逆汤配伍内涵研究多侧重于对正常生理条件下的甘草减附子之毒,以及病理条件下的干姜增附子之效的探讨,忽略了药物-机体-疗效/安全性的高度统一,以及生理因素对方剂配伍关系的影响,不利于对四逆汤配伍内涵的客观阐释。因此,本研究基于生物药剂学“药物-机体-效应”的相互影响环节,采用整体药效学、代谢组学、网络药理学、组学-生物信息学关联分析的整合研究方法,利用正常动物与模型动物对四逆汤方剂配伍关系及其配伍机制进行综合探讨,以期更加全面客观诠释四逆汤方剂配伍关系的科学本质,为其安全、有效的临床用药提供参考。主要研究内容如下:(1)四逆汤处方制法的古今差异分析:通过梳理古代医籍与现行版《中国药典》中四逆汤的收载情况,发现四逆汤在处方组成、药物比例结构方面保持了良好的延续性;在入药品种与制法方面,古代医籍记载与《中国药典》标准存有一定差异,即古代医籍均以生附子与炙甘草(实为炒甘草)入药,采用复方合煎方式制备,《中国药典》中以淡附片与蜜炙甘草入药,采用分煎制备工艺,但根据本论文的前期工作,《中国药典》收载四逆汤(简称药典法四逆汤)在药效与安全性方面更具优势,更能满足现代人们生活习惯和生活节奏,更适宜于现代社会的用药要求;通过对现有四逆汤工艺优化研究的分析,发现相关研究因处方组成、评价指标、比对基准等问题,难以证明其优化结果相较于《中国药典》制法工艺的优越性。因此,仍以药典法四逆汤开展相关研究为宜。(2)四逆汤方剂配伍关键环节的药效学研究:通过建立慢性心力衰竭大鼠模型,以模型大鼠与正常大鼠模拟机体不同生理条件,以相同指标评价四逆汤方剂配伍在不同生理条件下的药物效应差异。研究结果发现,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可有效改善模型大鼠BNP、CK、LDH、c Tn T、CRP、TNF-α等指标的异常水平,改善模型大鼠心肌组织病理形态学特征,表现为药物治疗效应,且附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的药效作用优于附子单煎液。同时,研究结果表明,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可导致正常大鼠CK、LDH、c Tn T水平的异常升高,诱发正常大鼠心肌组织病理损伤,表现出不同程度的损伤作用,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的毒性均低于附子单煎液。由此,基本明确了配伍增效是附子甘草配伍与附子干姜配伍在病理条件下的核心配伍关系,配伍减毒则是二者在正常生理条件下配伍关系的核心内涵。(3)四逆汤方剂配伍关键环节的代谢调控差异研究:针对生物药剂学中的重要环节,利用代谢组学技术研究发现,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可改善模型大鼠的代谢紊乱状态,回调相关代谢物的相对表达量,所涉及代谢通路具有共性,表现出药效方面的相似性。但相较于附子单煎液,附子甘草合煎液、附子干姜合煎液以及四逆汤可调控代谢物种类更多,对相同代谢物的调控力度更优,表现出配伍增效的配伍关系。同时,研究结果显示,附子单煎液、附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤均可导致正常大鼠代谢物的相对表达量异常变化,不同煎液对相同代谢物的作用趋势基本一致,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤对代谢物的干扰作用低于附子单煎液,表现出配伍减毒的作用。通过进一步分析发现,相同煎液对模型大鼠或正常大鼠体内同一代谢物的调控趋势基本相同,在不同生理条件下,代谢物的相对表达量相较于正常值是否发生偏离,是导致药物调控意义发生改变,进而表现为药效或毒性的重要原因。(4)四逆汤方剂配伍增效减毒机制的网络药理学研究:通过研究发现,附子抗心力衰竭药效网络由66个成分,43个靶点,10条通路构成;附子与甘草配伍后,药效网络中的靶点增加至49个,参与成分292个,新增作用通路3条(血管平滑肌收缩、血清素能突触、Rap 1信号通路);附子与干姜配伍后,药效网络中的靶点增加至47个,参与成分188个,新增作用通路2条(血管平滑肌收缩、Rap 1信号通路);四逆汤全方配伍可调控靶点49个,参与成分414个,作用通路13条;由此分析,四逆汤配伍增效机制可能与调控靶点、参与成分、作用通路的增加相关,并通过钙信号通路、c GMP-PKG信号通路、神经活性配体-受体相互作用、c AMP信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号、肾素分泌、血管平滑肌收缩、心肌收缩、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、肾素-血管紧张素系统、血清素能突触、Rap 1信号通路等具体通路实现。同时,研究发现附子心脏毒性网络由46个成分,16个靶点和心肌细胞肾上腺素能信号通路构成,附子与干姜配伍后相关靶点未富集到具有显著性意义通路,提示干姜对附子减毒作用较弱;附子与甘草配伍后可通过心肌细胞肾上腺素能信号、醛固酮合成与分泌等18条通路对附子心脏毒性发挥针对性与综合性的调控作用,而四逆汤全方配伍后毒性调控通路与附子甘草配伍环节一致,揭示了甘草在四逆汤全方配伍减毒作用中的主导地位。(5)代谢组学结合网络药理学关联分析及验证研究:通过关联分析,发现心肌细胞肾点击此处上腺素能信号、钙信号通路、c AMP信号通路、c GMP-PKG信号通路、肥厚型心肌病、肾素分泌、心肌收缩、神经活性配体-受体相互作用、血管平滑肌收缩、肾素-血管紧张素系统等通路是四逆汤方剂配伍增效机制的关键环节;降低附子对心肌细胞肾上腺素能信号、催产素信号通路、胰岛素信号通路等关键通路的影响,是四逆汤方剂配伍减毒机制的核心。进一步的Western blot验证实验证明,四逆汤不同配伍水煎液均可显著降低模型大鼠肾素-血管紧张素系统中ACE、ACE2、AngⅡ、ATR2等蛋白的表达,且相较于附子单煎液,附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的药效更优。同时,四逆汤不同配伍水煎液均可导致正常大鼠心肌细胞肾上腺素能信号通路中AKT、ERK、TNNI3等蛋白的表达显著升高,但附子甘草合煎液、附子干姜合煎液与四逆汤的升高作用较附子单煎液均有所降低。综上,本论文基于生物药剂学的“药物-机体-效应”联动环节,通过整体药效评价-代谢组学-网络药理学-组学关联分析的整合研究模式,探明了四逆汤RAD001 IC50方剂配伍关系在不同生理条件下的核心内涵,即病理条件下以增效关系为配伍核心,正常生理条件下以减毒作用为配伍重点,并在此基础上对其配伍机制及关键环节进行了探索,进一步客观阐释了四逆汤方剂配伍的科学实质,也为其临床用药、用药风险预警、质量标准提升等相关研究提供了参考。