树突状细胞(Dendritic cells,DCs)作为“免疫系统哨兵”游走身体各个部位去感知微环境,接收抗原信息调节CD4~+T细胞增殖与分化,诱导免疫活化和免疫耐受。多糖是红托竹荪中含量最高的生物活性成分,具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎和抗氧化等活性功能,但其发挥生物活性功能作用的机制尚不明确。本文以红托竹荪子实体中提取的葡聚糖(Polysaccharide from Dictyophora rubrovolvata,DRP)为研究对象。首先使用环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)诱导Balb/c小鼠建立免疫抑制模型,以评价DRP对免疫抑制小鼠的改善作用。其次,通过诱导骨髓树突状细胞(Bone marrow dendritic cells,BMDCs)研究DRP对免疫细胞的激活作用。采用RNA-seq技术和生物信息学分析对DRP促进DCs成熟的潜在分子机制进行研究。在确认了DRP促进DCs成熟后,进一步探究了DRP激活的DCs对初始CD4~+T细胞(Na?ve CD4~+T cells)增殖与分化的影响。主要研究内容和结果如下:(1)检测DRP对CTX诱导的小鼠免疫抑制和肠道损伤的影响。结果表明高剂量的DRP显著控制小鼠体重下降趋势(P<0.01),脾脏和胸腺器官指数对比CTX模型组的1.36 mg/kg和0.6452 mg/kg,DRP高剂量组分别增加18.85%和45.98%。HE染色结果显示DRP能够增加脾脏的白髓面积和结肠的隐窝深度(P<0.001)。免疫组化检测进一步发现DRP上升脾脏和结肠中的CD3~+T细胞数量(P<0.01)。免疫荧光特异性染色发现DRP干预组脾脏中的Th17细胞数量也有所上升。此外,AB-PAS染色结果显示DRP组小鼠结肠杯状细胞数量都有显著的增加作用,平均杯状细胞数量上升32.68%。同时,DRP对NLRP3蛋白的表达也有抑制效果(P<0.001)。以上结果说明DRP改善了CTX诱导的小鼠免疫抑制和肠道损伤。(2)探究DRP促进DCs成熟的基因表达变化及信号通路。首先,通过流式细胞分析术和ELISA实验检测DRP对DCs激活的影响,结果表明DRP显著提高表面共刺激分子CD86、CD80的表达(P<0.001),增加IL-6、TGF-β和IL-12细胞因子的分泌,这证明DRP激活DCs。其次,基于流式细胞分选术得到高纯度的BMDCs,然后利用RNA-seq技术获得DRP刺激后BMDCs的转录组序列信息,结果显示DRP处理的BMDCs细胞中的差异表达基因共有2607个。此外,KEGG、GO和GSEA富集分析结果显示DRP上调BMDCs的“Clec4e”、“STAT1”和“AKT”基因表达以及“C-型凝集素受体”“PI3K-AKT”“细胞因子相互genetic prediction作用”和“Th17细胞分化”信号通路。(3)基于RNA-seq结果,进一步揭示DRP对DCs表面C-型凝集素受体和“PI3K-AKT”信更多号通路的影响。利用流式细胞分析、Western blot实验发现Sy K抑制剂可显著降低DRP诱导DCs表面共刺激分子的高表达,相较于高剂量的DRP组,Sy K抑制剂组的表达降低了50%。此外,DRP增加了AKT和STAT1蛋白的磷酸化以及细胞免疫荧光显示DRP增加STAT1蛋白入核(P<0.01)。综上实验结果表明DRP能够通过Mincle(Clec4e)受体调节DCs中的AKT-STAT1信号通路进而促进DCs成熟。(4)通过体外建立BMDCs-Na?ve Cselleck HPLCD4~+T共培养实验模型探究DRP刺激的DCs是否增殖Na?ve CD4~+T细胞并向Th17细胞极化。CFSE实验检测发现DRP刺激的BMDCs能够促进Na?ve CD4~+T细胞的增殖。进一步使用流式细胞分析增殖后的Na?ve CD4~+T细胞和ELISA实验检测共培养体系中的细胞上清,发现DRP刺激的BMDCs能够诱导Na?ve CD4~+T细胞极化成Th17细胞。这些结果表明DRP激活的BMDCs能够极化Na?ve CD4~+T细胞,促进免疫激活。综上所述,证实DRP具有免疫调节活性。动物实验发现DRP激活了CTX诱导的免疫抑制小鼠的免疫系统并改善了肠道损伤。体外细胞实验揭示DRP的免疫调节能力是通过膜表面受体Mincle上调AKT-STAT1信号通路来激活DCs,而DRP激活的DCs能促进Na?ve CD4~+T细胞的增殖和分化。这项研究不仅为DRP的免疫调节活性研究提供新的思路,也为DRP免疫调节产品开发提供理论依据。