背景军事应激是军人对军事活动环境和军事活动形式刺激的认知评价而产生的心理及生理反应。军事应激往往具有不可预知性,且军事应激源如连续作战、作息扰乱、极度疲劳、高温高寒、暴力恐怖情景甚至大规模杀伤性武器往往较为激烈且复合存在,因此部分军人出现抑郁、焦虑等情绪障碍及认知功能受损,严重影响部队战斗力,造成部Hp infection队非战斗减员。据一项针对某部1100名参与实弹演习的军人调查研究显示,军事应激症候检出率高达85.0%,并且随着应激症候检出率的提高,军人抑郁、焦虑的程度逐渐加重。开展慢性军事应激(Chronic unpredictable military stress,CUMS)防护研究具有重要意义。前额叶皮质(Medial prefrontal cortex,m PFC)及海马(Hippocampus)是大脑中控制注意、执行功能、记忆以及情绪反应的重要区域,情绪障碍及认知缺陷疾病患者相应脑区体积减小以及出现突触可塑性改变。慢性应激导致机体认知及情绪稳态失衡的发病机制较为复杂,突触可塑性降低,线粒体功能紊乱及免疫炎症都与其发生及发展有关。近年研究表明,慢性不可预知应激导致机体昼夜节律紊乱可能是认知及情绪稳态改变的启动机制。沉默信息调节因子1(Silent information regulator 1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD~+)依赖的去乙酰化酶,与细胞衰老、寿命延长、抗氧化应激和能量代谢等细胞多种功能活动有关。近期研究表明人和啮齿类动物中枢神经系统,尤其在前额叶皮质、海马、基底神经节等脑区高表达SIRT1,在多种啮齿类认知障碍、抑郁模型中海马SIRT1表达及活性降低,并且抗抑郁药物可上调其表达,提示SIRT1在情绪及认知稳态调节中可能发挥着重要作用。既往研究发现,SIRT1可调节可塑性关键蛋白环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(Cyclic-AMP response binding protein,CREB)和脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor,BDNF)转录从而影响神经元突触可塑性;另一方面SIRT1还可通过对过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α,PGC-1α)去乙酰化修饰从而调节其活性,PGC-1α与其下游目标基因核呼吸因子1(Nuclear respiratory factor,1NRF-1)结合共转录激活线粒体转录因子A(Transcription factor A,mitochondrial,TFAM)的表达从而调节线粒体转录及生物合成能力。越来越多研究证实,SIRT1转录表达及活性受生物钟调控。核心钟基因昼夜节律运动输出周期kaput(Circadian locomotor output cycles kaput,CLOCK)/芳香烃受体核转运体样蛋白1(Basic helix-loop-helix ARNT like 1,BMAL1)通过驱动钟控基因NAD~+合成酶——烟酰胺磷酸核糖转移INCB28060研究购买酶(Nicotinamide Phosphoribosyltransferase,NAMPT)转录影响NAD~+胞内浓度,进而影响NAD~+/NADH动态调节,从而调节SIRT1酶的节律性振荡。因此,我们推测慢性应激状态下生物钟扰乱及SIRT1异常是诱发认知功能及情绪稳态改变的重要病理机制,纠正生物钟系统进而维持SIRT1表达及丰度的节律性变化,可能是情绪及认知稳态调控的重要途径。紫檀芪(Pterostilbene,PTE),是一种广泛存在于蓝莓、黑莓、葡萄等浆果中的植物化学物,具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎等健康生物学效应。国外研究发现口服紫檀芪可以通过BDNF/CREB相关信号通路,影响海马及内侧前额叶皮质区神经发生,从而提高慢性应激大鼠的行为能力,缓解抑郁样症状;另外紫檀芪对衰老相关疾病如阿尔兹海默症的认知功能也有一定的改善作用,但其具体作用机制不清。课题组前期研究证实,PTE可以提高睡眠剥夺应激条件下小鼠耐力,推测其防护效应可能与维持骨骼肌生物钟节律有关。维甲酸相关孤核受体(Retinoic acid-related orphan nuclear receptors,RORs)是一种属于类固醇激素受体超家族成员的转录调控因子,可以参与核心钟基因BMAL1的转录调控,同时也是糖脂代谢的关键基因,对新陈代谢起着关键作用。通过文献及构效分析,PTE与RORγ激动剂川陈皮素结构类似,其是否也可作为生物钟的小分子调节剂参与SIRT1昼夜节律维持,进而改善CUMS暴露小鼠认知及情绪稳态,亟待研究证实。基于以上分析,我们提出“紫檀芪可激活RORγ并影响ROR-BMAL1生物钟反馈回路,参与SIRT1活性及丰度的节律性振荡调控,以维持不可预知军事应激条件下情绪及认知功能稳态”的假设,因此,本研究拟在构建模拟慢性不可预知军事应激小鼠模型基础上,选用C57BL/6J小鼠,采用行为学实验、免疫印迹、生物节律分析、荧光素酶报告基因检测及小动物活体成像等技术,深入研究PTE能否改善CUMS暴露条件下小鼠认知功能及情绪稳态失衡,并重点探讨生物钟介导的SIRT1调控在其中发挥的作用及分子机制。本研究将为紫檀芪用于慢性军事应激条件下军事作业人员情绪及认知功能维护奠定理论基础。目的深入研究一种广泛存在于葡萄、蓝莓等浆果中的多酚类植物化合物——紫檀芪(Pterostilbene,PTE)能否改善CUMS暴露条件下小鼠情绪及认知功能失衡,并重点探讨生物钟介导的SIRT1调控在其中发挥的作用及分子机制,为紫檀芪应用于部队奠定基础。方法1.选用6-8周龄C57BL/6J雄性小鼠为受试动物,随机分为对照(CON)组、慢性不可预知军事应激暴露(CUMS)组、慢性不可预知军事应激暴露+紫檀芪干预(CUMS+PTE)组。采用高分贝噪音(120d B)、闪光(3k W)、禁食、禁水、睡眠限制、大强度游泳等操作模拟军人日常所经历的军事应激事件。CUMS组和CUMS+PTE组每日随机接受不同种类的军事应激暴露,持续30天;在CUMS暴露期间每日给予CUMS+PTE组小鼠100 mg/kg.BW紫檀芪灌胃。CUMS暴露期间定期记录小鼠进食量及体质量,CUMS暴露结束后次日进行行为学实验,第三日于ZT2(10:00)时间点采集小鼠血清及组织样本,ELISA法检测血清皮质酮含量;Seahorse细胞能量代谢仪进行离体海马区线粒体呼吸功能实验,TEM观察小鼠海马及m PFC区线粒体及神经元形态、兴奋性突触密度,高尔基染色实验检测小鼠海马及m PFC区树突棘密度;RT-q PCR检测小鼠线粒体DNA拷贝数、Sirt1基因,线粒体生物合成相关基因Pgc-1α、Nrf1、Tfam,突触可塑性关键基因Creb、Bdnf、Syp相对表达含量;蛋白质免疫印迹检测小鼠海马及m PFC区SIRT1、PGC-1α、CREB、BDNF、SYP蛋白表达水平。2.采用CLOCKLAB生物节律采集分析系统分析小鼠自发活动昼夜节律变化;于ZT2(10:00)、ZT8(16:00)、ZT14(22:00)和ZT20(次日04:00)4个时间点进行血清及组织取样,采用ELISA试剂盒检测不同时间点血清皮质酮水平;RT-q PCR和蛋白质免疫印迹技术分别检测不同时间点海马及m PFC区Clock,Bmal1,Rorγm RNA及蛋白表达水平;ELISA试剂盒检测不同时间点海马及m PFC区SIRT1蛋白表达水平;RT-q PCR和蛋白质免疫印迹法分别检测不同时间点Nampt m RNA及蛋白表达水平;比色法试剂盒检测各时间点NAD~+/NADH比值。通过余弦分析评估上述指标的昼夜节律变化。采用微量立体定位注射技术将Rorγ转录因子表达载体及Bmal1报告基因载体腺病毒转染至小鼠海马及m PFC区,荧光素酶报告基因联合小动物活体成像技术明确PTE对CUMS暴露小鼠海马及内侧前额叶皮质区RORγ及BMAL1表达的影响。结果1.PTE明显改善CUMS暴露小鼠认知功能及情绪失衡。(1)动物一般情况:CUMS暴露30d后CUMS组小鼠体质量、进食量显著低于CON组(P<0.0001),CUMS+PTE组小鼠体质量、进食量显著高于CUMS组(P<0.05)。CUMS较CON组组小鼠血清皮质酮水平明显升高,CUMS+PTE组较CUMS组血清皮质酮水平明显降低(P<0.05)。(2)认知水平相关行为学实验:与CON组相比,CUMS组小鼠Morris水迷宫穿越平台次数、新物体识别指数、Y迷宫自发交替率显著降低(P<0.05);与CUMS组相比,CUMS+PTE组小鼠Morris水迷宫穿越平台次数、新物体识别指数、Y迷宫自发交替率显著升高(P<0.05)。PTE明显改善CUMS暴露小鼠认知功能。(3)抑郁样情绪相关行为学实验:与CON组相比,CUMS组小鼠糖水偏好分数、旷场实验跨格次数、及活动距离明显降低(P<0.05),旷场实验不动时长、悬尾实验不动时长明显增加(P<0.05);与CUMS组相比,CUMS+PTE组小鼠糖水偏好分数、旷场实验跨格次数、及活动距离明显升高(P<0.05),旷场实验不动时长、悬尾实验不动时长明显减少(P<0.05)。PTE干预可明显改善CUMS暴露小鼠抑郁样行为表现。2.PTE调控SIRT1-PGC-1α通路及SIRT1–CREB-BDNF通路,改善CUMS暴露小鼠线粒体结构、功能和突触可塑性。(1)PTE干预可能通过调控SIRT1-PGC-1α通路,改善CUMS暴露小鼠线粒体结构及氧化呼吸功能和生物合成能力。TEM观察小鼠海马CA1区及m PFC区神经元线粒体形态结构发现:CUMS+PTE组海马CA1区神经元线粒体较CUMS组损伤更轻。m PFC区神经元线粒体与海马CA1区的电镜结果相一致,PTE干预小鼠m PFC区神经元线粒体损伤较CUMS组更轻。离体海马区线粒体呼吸功能实验:与CON组相比,CUMS组的基础呼吸、最大呼吸、储备呼吸显著增加(P<0.05);而与CUMS组相比,CUMS+PTE组最大呼吸、ATP生成能力及呼吸控制率明显改善(P<0.05)。分子生物学实验:CUMS+PTE组小鼠海马及m PFC区mt DNA拷贝较CUMS组显著升高(P<0.05)。同时,与CUMS组相比,CUMS+PTE组海马及m PFC区Pgc1-α、Nrf-1、Tfam、Sirt1 m RNA以及PGC-1α、SIRT1蛋白水平显著增加(P<0.05)。(2)PTE干预可能通过调控SIRT1–CREB-BDNF通路,维持CUMS暴露小鼠神经元突触可塑性。TEM观察CUMS组小鼠海马CA1和m PFC区的兴奋性突触密度低于CON组(P<0.05),CUMS+PTE组海马CA1和m PFC区域兴奋性突触密度高于CUMS组(P<0.05)。高尔基染色实验:与CON组相比,CUMS组小鼠海马及m PFC区进行海马CA1和m PFC神经元的树突棘密度显著降低(P<0.05)。与CUMS组相比,CUMS+PTE组小鼠的海马CA1区树突棘密度变大(P<0.05),m PFC区树突棘密度差异无统计学意义。分子生物学实验:与CON组相比,CUMS组小鼠海马及m PFC区Creb,Bdnf,Syp m RNA明显降低,CREB,BDNF,SYP蛋白表达同样降低;PTE干预改善CUMS暴露小鼠小鼠海马及m PFC区Creb,Bdnf,Syp m RNA(P<0.05)和CREB,BDNF,SYP蛋白的降低。3.PTE显著恢复CUMS暴露小鼠昼夜节律,调控海马及m PFC区NAMPT-NAD~+/NADH比值,纠正SIRT1酶昼夜节律振荡扰乱。(1)CUMS组小鼠自发活动、血清皮质酮水平昼夜节律性降低,海马及m PFC区Clock、Bmal1、Rorγ的m RNA,和CLOCK、BMAL1、RORγ蛋白昼夜节律紊乱;PTE干预显著恢复CUMS暴露小鼠自发活动、血清皮质酮水平昼夜节律振荡以及海马及m PFC区Clock、Bmal1、Rorγm RNA,和CLOCK、BMAL1、RORγ蛋白昼夜节律紊乱。(2)另外,与CON组相比,CUMS组小鼠海马及m PFC区Sirt1、Nampt m RNA、SIRT1、NAMPT蛋白昼夜节律紊乱;PTE干预显著恢复CUMS小鼠海马及m PFC区Sirt1、Nampt m RNA及SIRT1、NAMPT蛋白昼夜节律振荡。(3)与CON组相比,CUMS组小鼠海马及m PFC区NAD~+/NADH比值的昼夜节律紊乱,PTE干预显著恢复CUMS暴露小鼠海马及m PFC区NAD~+/NADH比值的昼夜节律振荡。PTE可能通过调控生物钟-NAMPT-NAD~+/NADH比值,恢复SIRT1昼夜节律振荡。4.PTE作为生物钟分子RORγ的小分子调节剂参与生物钟调控。利用MGLtoosl 1.5.6和Auto Dock＿vina 1.1.2软件进行分子对接以及紫檀芪构效关系分析后初步判定紫檀芪可能与RORγ相结合,继而采用荧光素酶报告基因技术联合小动物活体成像技术在活体条件下检测紫檀芪对RORγ及BMAL1的影响,实验结果表明:各组小鼠ROR~+转染海马及m PFC区BMAL1表达水平均高于ROR~-转染组;ROR~+转染各组小鼠ZT14时海马区荧光强selleck抑制剂度均高于ZT2时;在ZT2及ZT14时,CUMS/ROR~+组海马荧光强度均明显低于CON/ROR~+组(P<0.05);ZT14时,CUMS/ROR+组海马区荧光强度明显低于CON/ROR~+组(P<0.05);在ZT14时,PTE/ROR~+组海马及m PFC区荧光强度明显高于CUMS/ROR~+组(P<0.05)。通过荧光素酶报告基因联合小动物活体成像技术确定PTE可上调RORγ表达,进而恢复生物钟分子BMAL1昼夜节律振荡;PTE可能结合RORγ,参与生物钟调控。结论综上所述,PTE(100 mg/kg?bd)干预可有效改善CUMS暴露小鼠认知能力及情绪障碍;PTE可能通过调控RORγ活性从而参与海马及m PFC区生物钟节律系统调节NAMP活性及NAD~+/NADH比值的昼夜振荡节律,进而调节SIRT1昼夜振荡节律,影响线粒体功能及突触可塑性。本研究将为军事应激暴露导致认知及情绪失衡防治提供新思路。