研究背景类风湿关节炎(RA)是一种自身免疫性疾病,其特征为滑膜增生破坏骨和软骨组织,造成关节损伤、畸形甚至功能丧失,其中伴随一系列炎性因子释放。临床中可利用针对细胞因子TNF-α或IL-6的生物制剂缓解炎症。但是目前临床药物并不能完全治愈RA,亟需开发新的治疗手段。RA的临床治疗用药用于改善病情的抗风湿药柳氮磺胺吡啶、金诺芬可诱导铁死亡的发生。铁死亡是因代谢异常等生化过程引起的脂质过氧化物堆积造成的程序性细胞死亡。已有研究报道铁死亡参与多种疾病进展,通过针对铁死亡联合疗法是许多癌症的新兴治疗手段。铁死亡在调节炎症反应、信号传导中发挥重要作用。在RA中,活化的滑膜成纤维细胞通过分泌炎性因子、促血管生成因子、基质金属蛋白酶分子增强血管生成和软骨降解促进RA疾病进展。靶向滑膜成纤维细胞治疗方法并不能永久抑制其活化,因此探寻RA新的治疗方法至关重要。RA滑膜微环境中呈高活性氧状态,滑膜成纤维细胞却可耐受氧化应激异常增殖,提示滑膜成纤维细胞在炎性环境中可抵抗氧化压力生存,我们推测干预其抵抗作用并选择性去除成纤维细胞或可成为成纤维细胞异常活化相关疾病的治疗新策略。研究目的1.明确RA患者增生滑膜微环境中存在脂质过氧化及铁过载;2.探究RA增生滑膜RASF不同亚群铁死亡应答差异,阐明类风湿关节炎免疫微环境调控RASF脂质氧化平衡的机制;3.分析阐明RASF亚群功能异质性,明确不同细胞类群间细胞互作及脂质氧化平衡调控RASF分子机制;4.探究针对RA疾病中RASF不同细胞亚群进行选择性去除的治疗可行性。研究方法1.收集高、中疾病活动程度的RA患者关节滑液,并统计其临床资料;通过检测铁死亡相关指标MDA,8-OHd G及铁载量,确定其在不同活动程度RA患者中的表达水平差异。同时搜集骨关节炎(OA)患者、RA患者的病理标本,通过免疫组化检测COX-2、4HNE、ACSL4、FTH等铁死亡标志物,确定RA患者滑膜组织中铁死亡标志物水平。同时构建小鼠CIA模型,探究使用IWnt-C59配制KE/Lip-1增加/降低脂质氧化水平后对CIA小鼠疾病进展的影响,并利用多重免疫荧光染色检测增生滑膜中细胞亚群变化。2.利用已有文献报道测序平台数据,分析小鼠关节炎模型滑膜组织成纤维细胞可分为2群:包括铁死亡敏感群和铁死亡抵抗群;确定铁死亡敏感群及抵抗群细胞的表面标志物并在RA患者组织样本及小鼠组织样本中进行初步验证,探究两类成纤维细胞表面标志物的表达差异、细胞功能差异;并进一步根据前期探究结果,利用CIAwww.selleck.cn/products/MK-1775小鼠模型探究滑膜免疫微环境调控成纤维细胞铁死亡的具体机制。3.对RA患者滑膜组织进行单细胞测序,结合患者的疾病情况、血清细胞因子的表达,从生物信息学角度分析铁死亡敏感群与抵抗群差异及细胞-细胞间相互作用,并在RA患者原代成纤维细胞中验证不同细胞因子刺激下铁死亡敏感性及具体机制。滑膜成纤维细胞进行TNF-α刺激及RSL3、IKE、Ferrostatin-1、Adalimumab、PS1145等单独或联合处理后检测细胞活力及细胞死亡比例;WB(western blot)检测COX-2、GPX4等蛋白水平,并检测细胞内GSH水平,RASF经短期TNF-α、Adalimumab刺激后Western blot检测p65、IκB、p-IκB等蛋白水平。4.针对RA传统治疗手段的局限性,CIA小鼠模型中对RASF不同细胞亚群进行选择性去除缓解RA症状及降低软骨破坏;检测DAS28关节评分、掌指关节肿胀厚度;micro-CT检测骨侵蚀情况,H&E染色检测组织形态、Toluidine Blue、Safranin O染色检测软骨侵蚀情况;免疫组化检测成纤维细胞活化蛋白(FAP)、铁死亡敏感群微纤丝关联蛋白4(Mfap4)、铁死亡抵抗群酸性分泌蛋白类似蛋白1(Sparcl1)表达水平;Iron Detection Kit检测组织中铁载量;试剂盒检测组织中脂质过氧化产物丙二醛(MDA);免疫组化检测4HNE等脂质过氧化指标,PTGS2、GPX4等铁死亡标志物。研究结果1.利用多重免疫荧光染色、组织化学染色及MDA试剂盒等方法检测RA患者滑膜增生组织脂质过氧化物4HNEFemale dromedary、DNA损伤标志物8-OHd G、膜脂质过氧化终产物MDA以及铁载量,发现同OA患者相比,RA患者滑膜组织8-OHd G和4HNE水平更高;但在高活动度与中活动度RA患者滑膜组织中并未有显著差异。高活动度RA患者关节滑液中MDA水平以及铁载量均高于中等活动度患者。除脂质过氧化物生成增加外,高活动度患者滑膜关节积液中铁载量明显高于中活动度患者。同时构建CIA小鼠模型,发现与对照相比CIA小鼠关节滑膜组织IHC染色8-OHd G和4HNE呈强阳性,铁死亡诱导剂处理后显著减少CIA小鼠滑膜处成纤维细胞数量。2.单细胞测序重分析可依照已报道铁死亡调控基因将其分为潜在敏感群和抵抗群,通过多重免疫荧光染色鉴定出敏感群细胞表面标志物为Mfap4、抵抗群细胞表面标志物为Sparcl1;并且在RA组织及CIA小鼠组织中多重免疫荧光染色显示关节软骨侵蚀部分Mfap4~+成纤维细胞较Sparcl1~+成纤维细胞数量更多,GSEA分析预测提示铁死亡敏感群差异基因表达显著富集于细胞外基质形成与重塑;铁死亡抵抗群差异基因表达显著富集于细胞增殖及细胞周期相关基因,并且铁死亡抵抗群主要富集于TNF-α/NF-κB信号通路。3.利用GSH试剂盒、铁载量检测试剂盒、Western Blot、细胞活力及细胞死亡等实验,发现TNF-α影响铁死亡cystine/cysteine/GSH/GPX4核心通路,其中TNF-α转录调控SLC7A11进而增加GSH水平从而抵抗铁死亡发生;进一步通过荧光素酶报告基因实验检测,TNF-α影响下游NF-κB p65,导致细胞活力升高、细胞死亡减少,侵袭和迁移能力显著升高。4.构建CIA小鼠模型,设置TNF-α拮抗剂Etanercept处理组、铁死亡诱导剂IKE处理组、Etanercept联合IKE处理组,利用DAS28评分、测量爪垫肿胀厚度、组织化学染色、番红-固绿染色、多重免疫荧光染色等实验,确定各组发现Etanercept联合IKE处理组CIA小鼠DAS28评分降低,爪垫肿胀程度下降,关节炎症缓解,FAPα~+成纤维细胞数量显著下降;单独使用低剂量IKE或者Etanercept不能遏止关节炎症及骨和软骨破坏。研究结论1.在CIA小鼠关节炎模型中,高剂量铁死亡诱导剂IKE减少滑膜组织中成纤维细胞数量,并有效缓解RA进展。2.单细胞转录组分析发现,FAPα~+成纤维细胞包含两个具有显著铁死亡应答差异的亚群,TNF-α信号在铁死亡诱导抵抗的成纤维细胞亚群中显著激活。3.TNF-α通过激活NF-κB上调谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLM)和调节亚基(GCLC)的表达,促进细胞中谷胱甘肽(GSH)生物合成,保护成纤维细胞脂质过氧化压力逃逸,抵抗铁死亡。4.TNF拮抗剂Etanercept可显著增强低剂量IKE对于成纤维细胞的杀伤效果,并缓解关节炎症及软骨破坏,抑制RA进展。