研究背景:嗅上皮是哺乳动物成年以后唯一具备神经元再生能力的神经组织。嗅上皮的持续性神经发生为研究神经干细胞自我更新提供了一个独特的模型。嗅上皮是假复层上皮,主要由嗅神经干细胞、微绒毛细胞、鲍曼腺体/导管、支持细胞、嗅觉感觉神经元构成。嗅上皮基底部的嗅神经干细胞主要为水平基底细胞(horizontal basal cells,HBCs)和球状基底细胞(global basal cells,GBCs)。生理情况下,GBCs位于HBCs和未成熟嗅觉感觉神经元之间的基底嗅上皮;HBCs相对静止,并作为储备干细胞库,在嗅上皮严重损伤后激活。嗅上皮日常暴露于空气中,易于受到外界因素(如化学试剂、病毒、烟尘等)的影响。在轻度损伤时,GBCs可以快速大量增殖,分化为大多数嗅上皮细胞类型。在重度损伤情况下,HBCs被快速激活,增殖分化为GBCs和其他嗅上皮所需的细胞类型。嗅上皮受到损伤后,产生大量细胞死亡,同时也激活了嗅神经干细胞的增殖分化。但细胞死亡与嗅神经干细胞增殖分化的关系目前还不清楚,有待进一步研究。本课题首先观察了嗅上皮损伤后的细胞死亡类型,然后通过采用程序性细胞坏死关键分子受体相互作用丝苏氨酸蛋白激酶3(receptor-interacting serine/threonine-protein kin购买PF-03084014ase 3,RIPK3)基因敲除小鼠、混合谱系激酶结构域样假激酶(mixed lineage kinase domain like pseudokinase,MLKL)基因敲除小鼠,研究了程序性细胞坏死在嗅上皮损伤后嗅神经干细胞活化的作用。研究目的:考虑到程序性细胞坏死是嗅上皮损伤的直接后果,我们推测嗅神经前体细胞对损伤的反应即是对细胞死亡的反应。然而,嗅细胞死亡是否参与调节嗅上皮的反应性细胞增殖,至今未见研究。本课题通过采用程序性细胞坏死关键分子RIPK3基因敲除小鼠、MLKL基因敲除小鼠,研究程序性细胞坏死在嗅上皮损伤后反应性细胞增殖中的作用,以及坏死对于嗅上皮损伤后干细胞活化的机制。研究方法:1.采用C57野生型小鼠、RIPK3基因敲除小鼠、MLKL基因敲除小鼠和甲巯咪唑制备嗅上皮损伤模型。2.采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的d UTP缺口末端标记测定法(Terminal deoxynucleotidyl transferase d UTP nick end labeling,TUNEL)染色、活体碘化丙啶(propidium iodide,PI)标记法观察细胞死亡。3.采用Western Blotting检测程序性细胞坏死关键蛋白分子RIPK3、MLKL及磷酸化(p-MLKL)水平变化;Wnt信号相关蛋白分子(Axin2、β-catenin、Wnt2、SFRP1)表达水平变化;巨噬细胞极化相关蛋白分子(i NOS、Argnase-1、CD206)表达水平的变化;NF-κB信号通路相关蛋白分子(P65、p-P65、IκB、p-IκB)。4.采用Brd U/SOX2免疫荧光双标染色观察小鼠嗅上皮损伤后干细胞活化;OMP/DCX免疫荧光双标染色观察小鼠嗅上Torin 1核磁皮损伤后嗅神经元的再生。研究结果:1.嗅上皮损伤后3 d,嗅上皮细胞主要发生程序性细胞坏死,少量发生凋亡。2.RIPK3或MLKL基因敲除小鼠嗅上皮损伤后3 d,可观察到比野生型小鼠显著增Bioelectronic medicine多的嗅上皮神经干细胞增殖。3.MLKL基因敲除小鼠嗅上皮损伤后7 d,可观察到比野生型小鼠显著增多的新生嗅觉感觉神经元。4.与野生型小鼠相比,MLKL基因敲除小鼠嗅上皮损伤后3 d,嗅上皮可观察到显著增多的巨噬细胞浸润。5.MLKL基因敲除对嗅上皮损伤后Wnt信号和巨噬/胶质细胞的极化无明显影响。6.MLKL基因敲除可抑制嗅上皮损伤后的NF-κB信号激活。研究结论:1.嗅上皮损伤早期,细胞死亡以程序性细胞坏死为主,嗅上皮神经干细胞迅速活化。2.MLKL,RIPK3敲除可促进损伤后的嗅上皮干细胞活化及神经元再生。3.MLKL敲除对嗅上皮损伤后的Wnt信号激活无显著影响;MLKL与RIPK3敲除可促进损伤后嗅上皮巨噬细胞浸润;MLKL敲除可抑制嗅上皮损伤后的NF-κB信号活化。