【目的】1.研究痛泻要方对慢性应激下结直肠癌生长的干预效应。2.研究痛泻要方对肿瘤相关巨噬细胞极化的调节作用。3.探究痛泻要方通过JAK/STAT通路调控慢性应激下TAM极化抑制结直肠癌的分子机制。4.为拓展痛泻要方的临床应用提供实证依据。【方法】1.痛泻要方对慢性应激下结直肠癌生长的干预情况:将70只SPF级BALB/C小鼠;随机分为7个组,分别为空白组,对照组,模型组,米非司酮组,痛泻要方低、中、高剂量组;除空白、对照组不应激外,其余各组均采用慢性束缚应激方法构建应激性小鼠模型,通过小鼠行为学检测评估抑郁造模是否成功;造模成功后治疗组开始予以药液灌胃,在第14天对各组小鼠进行结肠癌CT26-luc细胞皮下瘤种植,空白组除外。接种后7天左右,通过小动物活体成像系统监测接种部位肿瘤的荧光信号以评估结肠癌小鼠模型是否构建的成功。期间观察各组小鼠体质量变化;通过检测应激后各组小鼠强迫游泳及悬尾实验的行为学改变情况,评价小鼠抑郁程度;通过ELISA法检测各组小鼠血清中CORT、5-HT、NE激素表达水平;通过小动物活体成像定期监测各组小鼠肿瘤生长情况;通过HE染色观察各组小鼠肿瘤组织病理改变。2.痛泻要方对肿瘤相关巨噬细胞M1及M2型的影响:首先用F4/80标记巨噬细胞、CD86标记M1型巨噬细胞、CD206标记M2型巨噬细胞;通过流式细胞术检测各组小鼠血清和肿瘤组织中F4/80、CD86、CD206占比情况;通过免疫荧光染色检测肿瘤组织中CD86、CD206巨噬细胞表达情况;通过ELISA法检测各组小鼠血清中M1型巨噬细胞炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-12,M2型巨噬细胞炎性因子IL-4、IL-10表达水平,通过q-PCR法检测各组小鼠肿瘤组织内巨噬细胞M1型相关基因IL-1β、TNF-α、Cxcl9、IL-12,M2型相关基因TGF-β1、IL-10、Arg1、IL-4的m RNA表达水平。3.痛泻要方对JAK/STAT通路调控慢性应激下TAM极化抑制结直肠癌的机制研究:通过q-PCR法检测各组小鼠肿瘤组织内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、STAT6的m RNA表达水平;通过Western blot法检测各组小鼠肿瘤组织内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、STAT6、p-STAT3、p-STAT6的蛋白表达水平。【结果】1.观察痛泻要方对慢性应激结肠癌小鼠一般情况,行为学变化,外周血内CORT、5-HT和NE含量变化,肿瘤局部病理的干预效果,评价痛泻要方对慢性应激结肠癌小鼠肿瘤生长的影响:1)慢性应激能够引起小鼠不同程度的抑郁样行为,痛泻要方治疗后能够改善小鼠精神状态及体重。2)行为学检测发现:慢性应激能够增加小鼠的静止不动时间;痛泻要方治疗后,小鼠静止不动时间显著降低(P<0.05,P<0.01)。3)慢性应激明显增加小鼠血清内CORT含量(P<0.01),明显降低5-HT和NE含量(P<0.05);痛泻要方治疗后,小鼠血清内CORT含量明显降低(P<0.01),明显升高5-HT和NE含量(P<0.05,P<0.01)。4)根据肿瘤生长曲线、小动物活体成像显示:慢性应激能够促进小鼠皮下肿瘤获悉更多生长;痛泻要方治疗后,小鼠皮下肿瘤生长较缓慢。5)根据瘤体重量、肿瘤大小及肿瘤抑制率计算结果显示:慢性应激能够增加瘤体重量,且肿瘤组织较大,能够促进肿瘤细胞生长;痛泻要方治疗后,小鼠瘤体重量减轻,肿瘤体积减小,能够抑制肿瘤细胞生长。6)HE结果显示,慢性应激干预后的肿瘤组织中细胞生长活跃,异型性明显,病理性核分裂象多见;而痛泻要方治疗后,肿瘤细胞密度稀疏,细胞体积较小,肿瘤组织内均有不同程度坏死现象。2.观察痛泻要方对慢性应激小鼠外周血及肿瘤组织内巨噬细胞及其M1和M2型占比,比对M1型及M2型相关炎性因子及相关m RNA表达,评价痛泻要方对慢性应激下M1型及M2型的影响:1)流式细胞检测结果显示,慢性应激明显下调小鼠外周血及肿瘤组织内F4/80和CD86比值(P<0.01),显著上调CD206占比(P<0.05,P<0.01);痛泻要方治疗后,F4/80和CD86占比明显上升(P<0.05,P<0.01),CD206占比明显下降(P<0.01)。2)免疫荧光结果显示,慢性应激降低小鼠肿瘤内CD86表达(P<0.01),明显升高CD206表达(P<0.01);痛泻要方治疗后,小鼠肿瘤内CD86表达明显上升(P<0.05,P<0.01),CD206表达明显下降(P<0.01)。3)ELISA检测结果显示,慢性应激下调小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-12表达(P<0.05,P<0.01),LY294002供应商上调IL-4和IMedicina perioperatoriaL-10表达(P<0.05);痛泻要方治疗后,明显上调小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-12表达(P<0.05,P<0.01),明显下调IL-4和IL-10表达(P<0.05,P<0.01)。4)qPCR结果显示,慢性应激降低小鼠肿瘤组织内IL-1β、TNF-α、Cxcl9、IL-12 m RNA表达,升高TGF-β1、IL-10、Arg1、IL-4 m RNA表达(P<0.05,P<0.01)。痛泻要方治疗后,上调小鼠肿瘤组织内IL-1β、TNF-α、Cxcl9、IL-12 m RNA表达(P<0.05,P<0.01),下调TGF-β1、IL-10、Arg1、IL-4 m RNA表达(P<0.05,P<0.01)。3.观察痛泻要方对慢性应激小鼠瘤体内JAK/STAT信号通路蛋白表达的影响,探究痛泻要方在慢性应激下调控巨噬细胞极化抑制结直肠癌生长的分子机制。1)q-PCR结果显示,慢性应激升高小鼠肿瘤组织内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、STAT6基因表达(P<0.05,P<0.01),痛泻要方治疗后,下调小鼠肿瘤组织内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、STAT6基因表达(P<0.05,P<0.01)。2)Western blot结果显示,慢性应激促进小鼠瘤体内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、P-STAT3、STAT6、P-STAT6蛋白表达上升(P<0.01);痛泻要方治疗后,小鼠瘤体内JAK1、JAK2、JAK3、STAT3、P-STAT3、STAT6、P-STAT6蛋白表达下降(P<0.05,P<0.01)。【结论】1.痛泻要方可有效抑制慢性应激下结直肠癌的生长过程,且以中剂量效果为佳。2.痛泻要方能够促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化,改善慢性应激下肿瘤免疫微环境,抑制结直肠癌的发展,可能与其抑制JAK/STAT信号通路有关。